用于区分茶叶产地的分枝菌素木质素甲氧基团的化合物特异性氢同位素分析：与双水平衡法的比较

氢稳定同位素分析揭示高海拔对斯里兰卡红茶质构的影响，通过GC-IRMS法测定木质素甲氧基氢同位素组成，发现其δ2H值随海拔升高显著下降（-123‰至-150‰），与双水汽平衡法结果高度吻合（相关系数0.915），证实非交换性氢可稳定反映水源同位素特征，为地理标志认证提供新方法。

　　

Kasun Binduhewa|B.A.T. Amalka|Champa K. Dissanayake|Rohana Chandrajith|L.S.K. Hettiarachchi|M.A.B. Ranatunga

斯里兰卡原子能委员会，60/460 Baseline Road，Wellampitiya，斯里兰卡

摘要

植物组织中的氢稳定同位素组成编码了与海拔高度相关的气候信号，这些信号可以用于验证地理来源。然而，整体氢同位素测量会将可交换和不可交换的氢池混合在一起，从而掩盖了气候信号。通过对木质素甲基氧基团进行化合物特异性分析，可以研究一个化学性质均匀、不可交换的氢池，该氢池保留了源水的同位素特征。在这项研究中，通过化合物特异性气相色谱-同位素质谱（GC–IRMS）分析了木质素甲基氧基的δ²H值，并将其与使用双水蒸气平衡法独立得到的不可交换δ²H值进行了直接比较，以评估方法的一致性和稳健性。该方法应用于45个来自斯里兰卡的 orthodox 黑茶样本，这些样本分别来自低海拔、中海拔和高海拔种植区。甲基氧基的δ²H值随海拔升高而系统性地降低，从低海拔的?123 ± 3‰降至高海拔的?150 ± 2‰，在大约2000米的范围内形成了27‰的梯度。方差分析表明海拔是变异的主要来源，解释了99.5%的总变异（F = 4202，p < 0.001）。通过与双水蒸气平衡法得到的不可交换δ²H值的直接比较，评估了方法的表现，结果显示两者高度相关（r = 0.9149，斜率 = 0.9601）。所有样本中的可交换氢比例保持一致（18.49 ± 1%），表明所有海拔处的氢键环境相似。Bland–Altman分析显示方法间的一致性是可预测的，存在系统性的偏移量?23‰。尽管存在系统性的偏移量，但强烈的比例一致性表明化合物特异性甲基氧基δ²H分析得出的结果与基于平衡的方法一致，同时提供了一种更直接、化学定义更明确的不可交换氢的测量方法。这些发现突显了化合物特异性甲基氧基δ²H分析作为区分斯里兰卡茶叶地理来源的地球化学标记物的潜力，并为未来多实验室评估基于同位素的认证框架奠定了基础。

引言

茶叶是一种全球交易的农产品，其市场价值取决于地理来源及其相关的感官和质量特性。在斯里兰卡，高海拔种植的茶叶具有独特的感官特征和市场价值，这为欺诈性标签和替代行为提供了经济动机[1]。随着国际供应链的复杂化，对可靠的分析工具的需求日益增加，以验证茶叶的地理来源。稳定同位素分析被认为是食品认证中最有效的方法之一，因为同位素特征编码了无法人为操纵的环境、地理和气候信息[2, 3, 4]。氢同位素（δ²H）作为来源地的特别有价值的指标，因为它们对区域水文过程和降水动态非常敏感[5, 6]。

当地降水水的同位素组成主要影响植物组织中δ²H的环境效应[7]。由于瑞利蒸馏效应和地形抬升过程中的降水作用，δ²H值随海拔升高而降低，这种关系被称为海拔效应[8, 9, 10]。同位素梯度是由于空气在上升过程中冷却造成的。在冷却过程中，较重的同位素更容易凝结，导致剩余的蒸汽和降水在较高海拔处逐渐贫化。典型的中纬度梯度约为每1000米6–8‰，但在具有强烈季风循环和快速地形抬升的热带高地地区，梯度更为陡峭[8, 11]。由于茶叶在生长过程中从当地水源获取氢，因此与降水相关的同位素差异预计会直接影响茶叶组织的同位素组成。然而，提取这一信号是一个分析挑战。植物组织包含两种氢池：可交换氢和不可交换氢。可交换氢会迅速与大气中的水分达到平衡。不可交换氢则结合在结构中，并在生物合成过程中保留了源水的同位素特征[12]。整体δ²H测量结合了这两种氢池，常常掩盖了气候信号，降低了地理差异[13]。

多项研究已经应用整体δ²H或多元素同位素分析来区分不同地区的茶叶。然而，这些方法中整体δ²H数据的解释可能受到可交换氢的存在和基质特异性分馏效应的影响，特别是如果没有明确限制可交换氢的话。例如，Zhou等人[14]开发了一种使用多元素稳定同位素（δ¹³C、δ¹⁵N、δ²H和δ¹⁸O）结合化学计量学的方法来区分铁观音茶的地理来源和收获季节。Huang等人[15]报告了对贵州绿茶的类似区分效果。Liu等人[16]使用稳定同位素比率（δ²H和δ¹⁸O）和多元素数据（Na、K、Ni和Rb）对中国多个省份的绿茶进行了分类，区分率超过92.3%。此外，还使用基于同位素数据（δ²H和δ¹⁸O）和微量元素数据（Cs、Cu、Ca和Ru）的支持向量机来区分中国乌衣山茶和非乌衣山茶，准确率达到93.18%[17]。因此，本研究的目的不是质疑以往茶叶认证研究的有效性，而是强调整体δ²H测量中固有的方法学问题，即可能需要明确控制可交换氢以确保可重复性和实验室间可比性。这促使人们探索专门针对不可交换氢池的化合物特异性方法，因为这些氢池在收获后不太可能与大气的湿度达到平衡。

双水蒸气平衡提供了一种解决这一限制的方法，通过量化可交换和不可交换的氢部分[18]。在这种方法中，样品与两种具有不同同位素组成的参考水进行平衡，然后使用假设的可交换氢富集因子计算δ²H_nex（不可交换氢部分的氢同位素组成）。尽管这种方法广泛应用于纤维素和其他植物基质，但它需要多天的平衡时间，并且依赖可能不具有基质特异性的富集因子，从而引入了δ²H_nex估计的不确定性[19]。

化合物特异性同位素分析（CSIA）提供了一种替代途径。通过针对特定分子结构中的氢，CSIA绕过了整体校正的需要，避免了关于可交换与不可交换氢分配的假设。木质素衍生的甲基氧基团构成了一个化学性质均匀的不可交换氢池，其δ²H值反映了源水的同位素组成[20, 21]。经过酸解后，甲基氧基氢被释放并转化为甲基碘化物，用于气相色谱-同位素质谱（GC-IRMS）分析，从而提供了一种直接且化学定义明确的δ²H_nex测量方法。尽管GC-IRMS甲基氧基δ²H分析已应用于木材、植物材料和某些食品基质，但据我们所知，尚未有将其应用于茶叶认证的报道[22]。

本研究通过将GC-IRMS甲基氧基δ²H_nex分析应用于斯里兰卡的 orthodox 黑茶，并将这些测量结果与通过双水蒸气平衡法独立得到的δ²H_nex值进行验证，填补了这一空白。斯里兰卡是一个理想的评估同位素海拔区分的场所，因为其茶叶种植区从海平面延伸到超过2000米的高度梯度。斯里兰卡的茶叶种植区主要集中在中部高地和南部内陆地区。根据海拔高度，这些地区被大致分为高海拔种植区（1200米及以上）、低海拔种植区（从海平面到600米）和中海拔种植区（600米到1200米），并伴有明显的温度变化[23]。季风气流在陡峭地形上的影响放大了地形效应，可能增强了基于海拔的高度驱动的同位素分离[24]。收集了代表三个不同地理区域的样本，每个区域对应不同的海拔类别，以评估区域间的分离度和区域内的连贯性，从而评估δ²H_nex如何反映与海拔相关的气候差异。

本研究的目标是评估化合物特异性GC-IRMS甲基氧基δ²H_nex测量是否能够有效捕捉斯里兰卡茶叶中的海拔相关环境特征，并确定这些值在低海拔、中海拔和高海拔种植区之间的差异程度，这些区域由地理上不同的采样区域代表。此外，该研究还旨在量化可交换氢，并使用双水蒸气平衡法得出δ²H_nex值，从而能够独立评估可交换氢部分并直接比较这两种分析方法。通过检查GC-IRMS和双水方法之间的一致性、潜在偏差和比例关系，本研究旨在建立方法学的稳健性，并评估δ²H_nex作为区分斯里兰卡不同海拔地区茶叶的化合物特异性同位素标记物的可行性。这是一项概念验证研究，证明了分析的可行性并展示了方法间的一致性。该研究未包括盲样或故意标记错误的茶叶样本，因此不提供认证的监管阈值或决策规则。

样本收集

样本收集

共收集了45个来自三个地区的9家茶叶厂的 orthodox 黑茶样本：高海拔种植区（Nuwara Eliya区）、中海拔种植区（Kandy区）和低海拔种植区（Galle区）。每个样本代表一个独立的工厂生产批次，同一批次没有进行任何分析子采样。高海拔种植区包括Nuwara Eliya区内的地点（约1600–2000米），中海拔种植区包括Kandy区的工厂（约550–900米）

木质素甲基氧基团的GC-IRMS分析

对45个斯里兰卡茶叶样本进行了木质素甲基氧基团的GC-IRMS分析，得到了随海拔变化的可交换δ²H（δ²H_nex）平均值（表1）。

低海拔种植区的样本显示δ²H_nex值为?123.0 ± 3.0‰，中海拔种植区的样本值为?135.5±2.5‰，高海拔种植区的样本值为?149.5±2.1‰。随着海拔的升高，δ²H_nex值逐渐降低，形成了总共27‰的梯度

讨论

本研究首次应用化合物特异性氢同位素分析（δ²H_nex）通过GC-IRMS来分析茶叶中的木质素甲基氧基团，证明了其在区分基于海拔的来源地方面的有效性。传统的整体δ²H测量结合了可交换和不可交换的氢池，掩盖了气候信息，限制了地理区分[13]。相比之下，甲基氧基结合的氢代表了一个不可交换的、化学性质均匀的氢池，保留了

结论

本研究应用GC-IRMS化合物特异性氢同位素分析来分析茶叶中的木质素甲基氧基团，证明了其用于区分斯里兰卡黑茶海拔基础的可行性。对来自三个海拔区域（低海拔、中海拔和高海拔）的45个样本的分析显示，δ²H_nex值随海拔变化而一致，解释了观察到的99.5%的变异。这种强烈的关系反映了有意捕捉到的显著

CRediT作者贡献声明

Rohana Chandrajith：监督。Champa Dissanayake：项目管理、资金获取。Thilni Amalka：方法学、正式分析。Kasun Binduhewa：写作 – 审稿与编辑、原始草稿撰写、可视化、验证、软件使用、方法学研究、数据管理、概念化。Mahasen Ranatunga：监督。Saman Hettiarachchi：监督、概念化

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。