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快速灵敏的蛋白质检测方法：基于DNA开关与双aptamer探针的微尺度热迁移传感技术，无需分离或固定化步骤，通过荧光信号差异实现目标蛋白（凝血酶、PDGF-BB）的高通量检测，适用于复杂生物样本分析。
韩鹏|赵强
中国科学院生态环境科学研究院环境化学与生态毒理学国家重点实验室，北京，100085，中国
摘要
在疾病诊断、药物发现、基础研究以及其他生物医学应用中，对蛋白质的快速和灵敏检测有着巨大的需求。新兴的微尺度热泳（MST）技术能够实时监测荧光分子在加热过程中的荧光响应，为传感器提供了一种有吸引力的选择。该技术具有无需分离和固定、比率测量、快速分析以及高通量的优势。在这里，我们开发了一种基于DNA开关的一步法、选择性和灵敏的MST传感器，该传感器通过将一对适配体探针结合在同一蛋白质上来实现蛋白质的检测。这两个适配体探针在末端共享一个短的互补序列，其中一个探针被标记了荧光团以输出信号。它们可以结合到蛋白质目标上，形成三明治复合物，从而显著提高适配体探针的局部浓度，互补序列会杂交在一起，组装成一个双链结构的DNA开关。在MST分析中加热时，DNA开关会被打开，产生与未结合适配体探针相比明显的MST响应差异。通过测量显著的MST信号变化，可以检测到凝血酶和血小板衍生生长因子BB（PDGF-BB）。所提出的策略对于各种目标蛋白质的灵敏和选择性检测具有前景。
引言
蛋白质在生命活动中具有许多重要功能，几乎参与了所有的生物过程。许多蛋白质被视为重要的生物标志物，因为蛋白质表达的异常与多种病理状况有关[1]，[2]。因此，蛋白质的识别、检测和定量对于临床检测、疾病的预防和治疗具有重要意义[3]，[4]。已经开发了多种蛋白质检测策略，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、质谱法、电化学传感器和表面等离子体共振（SPR）测定等[5]，[6]，[7]，[8]，[9]，[10]，[11]。尽管ELISA是具有高灵敏度的经典蛋白质分析方法，但免疫测定仍需要多个洗涤步骤，这些步骤既费力又耗时[5]，[9]。质谱方法具有高特异性和准确性，但通常需要专业人员和繁琐的步骤来进行蛋白质定量[7]，[8]。电化学传感器和SPR传感器可以提供灵敏的响应，但它们需要配体的固定或洗涤步骤[10]，[11]。在基础研究和实际应用中，开发简单、快速且灵敏的蛋白质检测传感器是可取的。
微尺度热泳（MST）是一种无需固定和分离的技术，可用于量化生物分子相互作用，显示出快速灵敏的目标定量潜力[12]，[13]，[14]。该方法能够监测样品溶液在红外（IR）激光加热下的荧光响应[12]。MST分析需要荧光配体，并记录归一化荧光信号Fnorm（Fnorm = Fhot/Fcold，其中Fhot和Fcold分别代表加热前后的荧光强度）[15]，[16]。MST信号主要受热泳效应和加热过程中荧光分子温度相关强度变化的影响，后者可以提供主要贡献[17]，[18]。MST对荧光分子性质的变化（如大小、电荷和构象）具有高灵敏度。根据目标结合和未结合荧光配体的MST信号差异，可以研究生物分子相互作用[12]，[13]，[14]。MST分析具有许多优点，例如在均匀溶液中测量、无需分离和固定、比率分析具有稳健的信号、快速简单的分析以及高通量。除了在分子相互作用表征中的广泛应用外，MST还为生物传感器中的信号转导提供了新的有吸引力的方法[19]，[20]，[21]。然而，由于结合事件中的响应变化较小，MST传感器面临一些挑战。基于热泳的荧光配体积累或构象变化增强可以帮助改善MST信号[18]，[22]。
适配体是短的单链RNA或DNA，能够以高亲和力特异性结合目标[23]，[24]，[25]。适配体具有许多优点，包括易于化学合成和功能化、稳定的结构以及低生产成本[23]，[24]，[25]，[26]。适配体已广泛应用于生物医学研究、临床检测、药物发现和食品安全领域[23]，[24]，[25]，[26]，[27]，[28]。基于适配体的蛋白质检测方法引起了广泛关注[24]，[29]，[30]，[31]，[32]。一些方法依赖于单个适配体与目标蛋白质的结合来诱导适配体的构象变化，从而产生可测量的信号变化[24]，[30]，[33]，[34]。三明治格式的适配体测定通过多个配体结合到同一对象上来提高结合亲和力和特异性[31]，[35]，[36]，[37]，[38]。由于适配体体积小且易于标记荧光团，它们适合用于开发MST传感器，适配体MST传感器结合了适配体和MST分析的优点[18]，[20]，[22]。荧光标记的适配体用于外泌PD-L1的MST定量，但MST信号变化较小[20]。通过截短适配体序列并改善加热过程中的适配体构象变化，开发了一种使用单个标记荧光团的MST传感器，用于检测免疫球蛋白E，并获得了较大的MST响应[18]。然而，这种适配体工程和截短可能会降低适配体的亲和力。此外，在MST传感器中使用单个适配体也可能导致非特异性结合和低选择性。
在这里，我们展示了一种基于双适配体与蛋白质结合组装的DNA开关的选择性、一步法和均匀蛋白质检测方法。使用了一对在末端共享短互补序列的适配体，其中一个适配体末端被标记了荧光团。它们可以结合到同一蛋白质目标上，导致两种适配体的局部浓度增加，并在末端杂交形成一个DNA开关。组装的DNA开关和未结合的适配体探针对在加热过程中表现出不同的响应。该MST传感器能够灵敏且选择性地检测两种重要蛋白质：凝血酶和血小板衍生生长因子BB（PDGF-BB），从而能够在复杂基质（如血清样本）中分析蛋白质目标。这种策略结合了蛋白质与适配体之间的多价相互作用和灵敏的MST分析，提供了一种在均匀溶液中快速选择性地检测蛋白质的新方法。
材料与试剂
所有DNA序列均由Sangon Biotech（上海）有限公司（中国上海）合成（见表S1）。人α-凝血酶、人β-凝血酶和人γ-凝血酶从Haematologic Technologies Inc.（佛蒙特州埃塞克斯 junction）订购。凝血酶原和转铁蛋白从MedChemExpress LLC（美国）购买。血小板衍生生长因子BB（PDGF-BB）从Sino Biological（美国）订购。血小板衍生生长因子AA（PDGF-AA）和AB（PDGF-AB）以及蛋白酶K从
基于双适配体结合的DNA开关的蛋白质MST传感器原理及凝血酶检测的可行性测试
图1说明了基于双适配体结合的DNA开关的蛋白质检测MST传感器的原理。使用了一对针对蛋白质目标的适配体探针。每个适配体探针都设计有通过多胸腺嘧啶间隔连接的适配体序列。其中一个适配体探针的3’端连接了荧光素（FAM），另一个适配体探针的5’端第一个碱基是鸟嘌呤（G）。
结论
总结来说，我们展示了一种基于双适配体与同一蛋白质结合组装的DNA开关的均匀一步法MST传感器，用于灵敏且选择性地检测蛋白质目标。一对适配体探针作为识别元件与目标蛋白质形成三明治复合物，其中一个适配体末端被标记了荧光团。目标蛋白质与双适配体探针之间的亲和结合诱导了DNA开关的形成，从而显示出明显的
CRediT作者贡献声明
赵强：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调、资金获取、概念构思。韩鹏：撰写 – 原稿撰写、可视化、实验研究
利益冲突声明
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致谢
我们感谢中国科学院的战略性优先研究计划（XDB0750100）和中国的国家重点研发计划（2024YFA0918802）的支持。
