一种具有较大斯托克斯位移（Stokes shift）和窄吸收峰的pH荧光探针，适用于细胞周期过程中溶酶体的成像研究

本研究设计并合成了一种新型pH荧光探针NAM，具有窄pH响应范围（5.0-7.4），高灵敏度及溶酶体靶向能力。该探针通过氨基酸基团解离实现pH特异性荧光变化，成功用于检测LPS诱导炎症、营养剥夺诱导自噬及氯喈干扰溶酶体pH的动态变化，并首次揭示细胞周期G0/G1至S期pH碱化，G2/M期酸化的阶段特异性波动，为实时观测pH相关生理病理过程提供工具。

　　

陈博超|张继祥|钟一帆|刘曦|徐吉|崔宁宁|周瑾

山东第二医科大学药学院，中国潍坊，261053

摘要

细胞内pH值在调节细胞功能中起着关键作用，其微妙的变化可能会影响正常的生理活动并导致各种疾病。尽管已经开发了许多用于检测活细胞微环境pH值的探针，但它们较宽的动态范围会导致成像边界模糊，并可能产生假阳性结果，从而影响对细微pH变化的准确检测。为了解决这些问题，我们设计并合成了一种新型的基于1,8-萘酐的pH荧光探针（NAM），该探针对pH变化表现出高度敏感，其pH转变范围仅为2.4个单位。NAM的pH响应性源于其苯胺基团的脱质子化，这一过程促进了分子内的电荷转移（ICT）。这一机制使NAM在569 nm处表现出显著的荧光增强效应，pKa值为6.71，斯托克斯位移为112 nm。此外，NAM能够特异性地靶向溶酶体，并成功用于检测由脂多糖（LPS）、营养剥夺和氯喹处理引起的细胞内pH变化。重要的是，我们首次证明了NAM能够在不同的细胞周期阶段进行pH成像分析。在从G0/G1阶段过渡到S阶段的过程中，细胞内pH值逐渐升高，然后在G2/M阶段迅速下降。这些观察结果反映了细胞周期进展过程中能量储存与消耗之间的动态平衡。NAM的这些独特特性使其成为研究与异常pH变化相关的生理和病理过程的有力工具。

引言

pH值在细胞增殖、凋亡和内吞作用等细胞过程中起着关键作用[1,2]。在真核细胞中，细胞内pH值在不同亚细胞区室中分布不均。各种细胞器的独特功能决定了每个区室内的特定pH值[3]。因此，不同的细胞器具有特征性的pH值：溶酶体（pH 4.5-5.5）、线粒体基质（pH 8.0）和细胞质（pH 7.2-7.4）[4],[5],[6]。每个细胞器都需要一个最佳的pH值来支持其正常的生理功能。特别是溶酶体，它是酸性的细胞器，负责协调细胞代谢过程并促进底物降解[7]。溶酶体在多种生物过程中发挥着重要作用，包括蛋白质水解、自噬和凋亡[8]。溶酶体pH值的失调与多种细胞活动和稳态相关，并与代谢性疾病、神经退行性疾病和炎症等疾病有关[9]。因此，对溶酶体pH变化的高度选择性和敏感性监测对于研究溶酶体相关的生理和病理过程至关重要。

作为基本的生物过程，细胞周期的精确调控对于核酸合成、细胞增殖和有丝分裂至关重要[10]。在整个细胞周期中，细胞内pH值（pHi）会波动0.2-0.5个单位，这种微小的pH变化会显著影响细胞周期的进展。例如，Pedersen等人发现pH值与有丝分裂期间的脱氧核糖核酸（DNA）复制密切相关。当pH值从7.30升高到7.40时，DNA和蛋白质的合成分别增加了3.5倍和4.8倍。相反，当pH值低于7.30时，DNA和蛋白质的复制会停止[11]。这项研究表明pHi对细胞周期的时间调控至关重要。在Saccharomyces cerevisiae中也观察到了类似的现象。Okreglak等人研究了Saccharomyces cerevisiae中的主要氨基酸储存区室——类似溶酶体的液泡，在细胞分裂前会碱化，而在细胞分裂后又会重新酸化[12]。因此，对细胞周期中pH变化的动态监测对于追踪进行有丝分裂的细胞的生理活动至关重要。

由于荧光探针具有高敏感性、特异性和时空分辨率[13],[14],[15]，它们被广泛使用。最近的进展开发了多种对pH变化敏感的荧光探针，用于研究活细胞中的pH相关生物过程[16],[17],[18],[19],[20],[21]。然而，大多数现有的pH敏感荧光探针具有较宽的动态范围（超过3个pH单位），其灵敏度不够高，容易产生荧光背景干扰，从而导致假阳性信号。这些限制严重影响了它们检测不同细胞周期阶段之间细微pH变化的能力。目前，具有狭窄pH转变范围的pH响应探针仍然很少。因此，有必要开发一种pH敏感荧光探针，使其具有最窄的酸碱转变范围，以便监测不同细胞周期阶段的pH动态。

在这里，我们通过向萘酰亚胺引入4-(2-氨基乙基)吗啉衍生物基团来提高pH响应性，并引入吗啉基团以靶向溶酶体（图1），从而设计并合成了一种新型的溶酶体靶向荧光探针（NAM）。NAM表现出112 nm的较大斯托克斯位移和pH特异性响应性。其狭窄的pH转变范围为5.0-7.4，使其能够精确检测这一关键生物窗口内的微小pH变化。NAM成功应用于监测多种病理条件，包括：（1）由脂多糖（LPS）引起的炎症细胞模型，（2）由营养剥夺引起的细胞自噬，以及（3）氯喹介导的溶酶体pH稳态改变。重要的是，NAM允许对细胞周期阶段的pH变化进行时空分析，揭示了特定阶段的振荡模式。这一进展为实时观察与pH相关的生理和病理过程提供了强大的成像平台。

部分片段

HepG2细胞中的pH荧光成像

HepG2细胞在含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中培养，培养温度为37°C，培养环境为加湿的5% CO₂气氛。细胞被接种在玻璃底培养皿上并让其粘附48小时。成像前，细胞接受指定处理，然后在37°C下与NAM（10 μM）共孵育30分钟。孵育后，细胞用PBS洗涤三次，使用共聚焦荧光显微镜获取荧光图像

探针NAM和NAP的设计与合成

我们选择了3-溴-1,8-萘酐作为荧光团。随后，通过引入4-(2-氨基乙基)吗啉或3-氨基丙基（三苯）膦基团来扩展π共轭系统，使得发射波长发生红移。此外，氨基在碱性条件下容易脱质子化，使其成为潜在的pH感应位点。同时，吗啉单元作为溶酶体靶向基团，确保探针在溶酶体中的积累

结论

我们开发了一种新型的pH敏感荧光探针NAM，其特征是112 nm的较大斯托克斯位移、pH特异性响应性和在活细胞中的溶酶体靶向能力。NAM成功应用于监测由LPS、营养剥夺和氯喹处理引起的动态pH变化。重要的是，其狭窄的pH转变范围使其能够在不同细胞周期阶段进行相位特异性的pH成像分析。结果表明，在从G0/G1阶段过渡到S阶段的过程中，

CRediT作者贡献声明

陈博超：方法学研究。张继祥：研究。钟一帆：研究。刘曦：研究。徐吉：软件。崔宁宁：方法学。周瑾：撰写 – 审稿与编辑。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们衷心感谢国家自然科学基金（编号：21705120）、山东省自然科学基金（编号：ZR2023MB001、ZR2017LB016）、泰山学者项目专项基金（编号：tsqn202211231）以及远都学者基金会的财政支持。