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本研究评估了游离虾青素（ASX）和负载虾青素的壳聚糖纳米颗粒（ASX-CNPs）作为精子冷冻延伸剂对埃及水牛的影响。实验表明，ASX-CNPs显著提高解冻后精子活力、膜完整性和抗氧化能力，减少异常精子，并提高受孕率24.28%，优于游离ASX。
Fatma Mohsen Shalaby|Ohoud Ali Saeed Alghamdi|Norah Yahya Hamdi|Amany Omar Elrefaie|Safaa Zaky Arafa|Fatma M. Ibrahim|Ali Ali El-Raghi|Kandil Abdel-Hai Ali Attia
沙特阿拉伯阿巴哈国王卡利德大学理学院生物系
摘要：
本研究评估了游离虾青素（ASX）和负载虾青素的壳聚糖纳米颗粒（ASX-CNPs）作为埃及水牛公牛精液冷冻保护剂的添加效果。研究使用了5头健康且具有生育能力的水牛公牛，在连续8周内收集了40份精液样本。符合质量标准的精液被混合以消除个体差异，然后用Tris-卵黄保护剂稀释，并分为三组：对照组（未添加任何添加剂）、添加127 μM游离ASX的组以及添加127 μM ASX-CNPs的组。精液样本在液氮中冷冻保存一个月后解冻进行评估。结果表明，与对照组和游离ASX组相比，添加ASX-CNPs显著提高了解冻后的精子活动能力、存活率、质膜完整性和顶体完整性（p < 0.05），同时精子异常情况也显著减少。此外，ASX-CNPs还改善了精子的运动学参数。抗氧化分析显示总抗氧化能力、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性显著增强，而一氧化氮、丙二醛和过氧化氢的水平显著降低。ASX-CNPs还减少了凋亡和坏死的精子数量，下调了促凋亡基因Bax和Caspase-3的表达，上调了抗凋亡基因BCL2。超微结构观察证实了精子膜、顶体和线粒体的完整性得到保持。此外，ASX-CNPs降低了精液中的微生物负荷，并提高了生育率，比对照组高出24.28%。总之，ASX-CNPs是一种有前景的纳米抗氧化剂添加剂，适用于水牛精液的冷冻保存，相比游离ASX具有更好的保护效果和更高的生育率。
引言
埃及水牛在埃及畜牧业中发挥着重要作用，提供优质的肉类和高品质的牛奶，支持农业生产力和国家经济发展[1]。其耐寒性和适应性使其成为许多农业社区的重要食物来源和收入来源[2]。为了提高繁殖效率并保护遗传多样性，应用精液保存技术已成为埃及水牛育种计划的重要组成部分[3]。然而，精液冷冻保存面临诸多挑战，因为冷冻过程可能导致精子受到亚致死性损伤和结构变化，从而降低其存活率和受精能力[4][5]。在冷冻过程中，精子会暴露于多种应激因素中，包括低温、冰晶形成、自由基产生以及渗透压升高[6]。冷冻-解冻循环引起的氧化应激会导致脂质和蛋白质变性、精子活动能力和存活率下降、线粒体、顶体和尾部的结构损伤以及DNA片段化[4][7]，同时还会对精子细胞造成物理和渗透压损伤。冰晶形成、渗透压应激以及冷冻和解冻过程中的膜不稳定都会影响精子的结构和功能，这凸显了冷冻损伤的多因素性质[8]。精子细胞中丰富的多不饱和脂肪酸使其容易发生氧化反应，导致抗氧化信号传导受损，并产生有害的蛋白质和脂质副产物[5]。将抗氧化剂添加到稀释后的精液中有助于在储存过程中保持精子质量[9][10]。抗氧化剂可以清除氧化分子，抑制精子膜中的脂质过氧化，保护精子的形态和功能[11]。因此，近期研究强调了使用富含抗氧化剂和保护剂的冷冻精液保护剂来减少冷冻损伤并维持精子质量的重要性[12]。类胡萝卜素常被用作此类添加剂[13]。
虾青素是一种来自叶黄素家族的红色类胡萝卜素，天然存在于Haematococcus pluvialis藻类中。它是一种强效抗氧化剂，能够中和单线态氧和活性自由基[14]。事实上，虾青素的抗氧化活性优于维生素E和C，有助于保护多种细胞的质膜免受脂质过氧化[11]。除了抗氧化作用外，多项研究表明虾青素还具有多种有益的生物活性，包括抗炎和抗癌作用[15][16]。据报道，在公牛精液保护剂中添加虾青素可以改善精子质量参数[10]。此外，虾青素补充剂还能提高冷冻-解冻后公鸡精子的抗氧化酶活性和质膜完整性，显示出其在应激条件下的保护作用[17]。虾青素还有助于在液体制备过程中保持公猪精子的质量，通过维持活动能力、运动学参数、存活率、质膜完整性、形态和DNA完整性[14]。然而，与其他类胡萝卜素一样，虾青素的水溶性较低，生物利用度有限，且在光照、热或氧气作用下容易迅速降解，这限制了其应用范围[18]。纳米载体作为一种创新的递送平台，可以克服虾青素等化合物的这些限制。通过改善靶向递送、提高稳定性和促进细胞吸收，这些纳米载体使虾青素能够保持稳定、更容易溶解并更有效地被吸收，从而扩展其治疗潜力。许多聚合物，特别是壳聚糖等多糖，在设计有效的药物递送系统中起着关键作用[7]。壳聚糖是一种天然存在的阳离子黏多糖，具有优异的生物降解性、生物相容性和低免疫原性，以及有价值的药理作用[20]。因此，它成为常用的药物载体，不仅具有药理作用和抗菌效果，还能提高所携带药物的吸收[21][22]。本研究旨在制备负载虾青素的壳聚糖纳米颗粒（ASX-CNPs），并评估其对解冻后水牛精子的保护效果，与游离ASX进行比较。我们研究了它们对精子质量、运动学参数、氧化状态、凋亡、微生物含量、结构完整性和妊娠结果的影响。
虾青素（ASX）负载壳聚糖纳米颗粒（ASX-CNPs）的制备
虾青素由AB Chem公司（埃及曼苏拉）提供，按照Elmorsy等人的方法制备ASX-CNPs[9]：将壳聚糖（2 mg/mL）溶解在含有1% Tween 80的1%醋酸中，然后超声处理15分钟以获得均匀溶液。使用2 N NaOH将溶液的pH值调至5以优化纳米颗粒的形成。随后加入0–3000 μM的虾青素，并再次超声处理5分钟
ASX-CNPs的表征
如图1所示，ASX-CNPs呈现出几乎均匀的球形形态，聚集程度较低，粒径范围为27至58纳米（图1B）。动态光散射（DLS）分析显示ASX-CNPs的平均粒径为63.5纳米，粒径分布指数（PDI）为0.324（图1C）。Zeta电位分析进一步证实其表面电荷为正46.5 mV（图1D）。这种正表面电荷导致了粒子间的静电排斥
讨论
有效的精液保存对于成功应用人工繁殖技术至关重要，因为水牛精子细胞特别容易受到寒冷引起的结构和氧化损伤[36]。水牛精子的冷冻会促进活性氧（ROS）的产生，加速脂质过氧化，破坏线粒体功能，并影响膜流动性，因为这些细胞中含有大量的多不饱和脂肪酸（PUFAs）
结论
本研究的结果清楚地表明，ASX-CNPs是水牛公牛精液冷冻保护剂的有效添加剂。添加ASX-CNPs显著提高了解冻后的精子质量，包括活动能力、存活率、质膜和顶体完整性，同时显著减少了精子异常情况。这些改善与氧化还原状态的改善有关，表现为总抗氧化能力（TAC）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性的增加
作者责任声明
我全权负责提交过程、与期刊的沟通以及回复审稿人的意见。同时确认所有合作者都已审阅并批准了手稿的最终版本，并同意将其提交给期刊。
CRediT作者贡献声明
Ohoud Ali Saeed Alghamdi：写作 – 审稿与编辑、可视化、验证、方法学、数据分析、概念化。Fatma Mohsen Shalaby：写作 – 审稿与编辑、监督、软件使用、资源管理、项目管理、方法学、研究实施、资金获取。Safaa Zaky Arafa：写作 – 审稿与编辑、软件使用、项目管理、方法学、数据分析。Fatma M. Ibrahim：写作 – 审稿与编辑、资源管理、方法学、数据分析。
数据可用性声明
支持本研究结果的数据可向通讯作者索取。
动物伦理和参与同意声明
本研究使用的所有程序和方案均得到了扎加齐格大学IACUC科学委员会的审查和批准（批准编号：ZU-IACUC/2/F/279/2026）。
动物伦理和参与同意声明
本研究遵循2010/63/EU指令，并按照ARRIVE指南2.0进行，确保了用于科学研究的动物的保护。
致谢
作者感谢沙特阿拉伯阿巴哈国王卡利德大学科学研究系通过RGP1/115/46号小型研究项目资助了本研究。
