无细胞的牙髓组织与同种异体细胞在牙髓再生中的应用

本研究探讨利用脐带Wharton’s Jelly间充质干细胞（WJ-MSCs）与脱细胞人牙髓基质（dDP）结合再生牙髓组织的可行性，发现dDP成功去除了细胞并保留关键ECM成分，WJ-MSCs有效定植并表现出向成骨、成牙和神经分化的能力，为再生牙髓学提供了新策略。

　　

Nora Sakina Mohd Noor | Xin-Jieh Lam | Ghee-Seong Lim | May-Nak Lau | Mang-Chek Wey | Abilashini Rajendran | Khong-Lek Then | Nazmul Haque | Noor Hayati Abu Kasim | Vijayendran Govindasamy | Noor Hayati Azami

马来西亚马来亚大学牙科学院修复牙科系，吉隆坡506030

摘要

再生性牙髓学旨在修复受损的牙髓-牙本质复合体，其目标不仅限于血管再生，还包括功能性组织的再生，其中包含神经再生。尽管牙髓干细胞（DPSCs）已得到广泛研究，但其临床应用受到细胞产量低和后期传代细胞再生能力下降的限制。本研究探讨了使用华通胶间充质干细胞（WJ-MSCs）作为替代异体细胞来源的可行性，并将其与脱细胞人牙髓（dDP）支架结合使用，作为功能性牙髓再生的关键平台。牙髓组织成功实现了脱细胞化，通过DNA和羟脯氨酸定量以及组织学和扫描电子显微镜（SEM）分析证实，I型和III型胶原蛋白得到了有效保存，同时细胞也被有效清除。随后，WJ-MSCs成功重新接种到dDP支架上，显示出与细胞外基质（ECM）的结合和迁移能力。重新接种后的dDP结构表现出向成骨和成牙方向分化的潜力，这一点通过茜素红染色显示的矿物质沉积以及成骨相关基因（DLX5、OSTERIX）和成牙相关基因（DSPP）的表达上调得到验证。此外，神经生成相关基因NCAM的表达上调，而抑制基因（TWIST2、MSX1）、血管生成相关基因（VE-CADHERIN、VEGF）和免疫调节基因（IDO1）的表达则下调。总体而言，这些发现表明将WJ-MSCs与dDP支架结合使用是一种可行的功能性牙髓再生方法，为再生性牙髓学的未来临床应用提供了有希望的途径。

引言

自20世纪60年代初首次描述牙髓-牙本质复合体以来，人们在尝试再生该结构方面取得了许多进展（Hargreaves等人，2013年）。过去，牙髓再生的概念是通过过度器械操作在根管区域诱导出血来实现的。Iwaya等人（2001年）和Banchs与Trophe（2004年）提出，由出血产生的内源性干细胞和血块可以通过血管再生促进坏死牙髓的根尖闭合（Banchs与Trophe，2004年；Iwaya等人，2001年）。后来提出了“复活”这一术语，因为根管空间中也再生了硬组织和软组织（Huang与Lin，2008年）。美国牙髓病学会最终同意采用“再生性牙髓学”这一术语（Murray等人，2007年），因为这种方法涉及将干细胞移植到支架中，并在定制的微环境中使其相互作用以再生牙髓-牙本质复合体（Kim等人，2018年）。

神经血管束由嵌入细胞外基质（ECM）中的结缔组织固定，构成了牙髓复合体，为细胞增殖和分化提供了支架，从而维持了功能正常的牙髓。因此，为了成功再生牙髓，支架在提供根管空间内的三维结构、促进细胞附着和植入方面起着至关重要的作用（Bottino等人，2013年；Li等人，2005年）。在牙髓再生中使用了多种支架，包括聚乳酸和胶原蛋白支架；然而，一个主要问题是缺乏类似牙髓ECM的生物活性支架。因此，构建一个能模拟牙髓ECM的生物活性支架对于促进功能性牙髓再生至关重要。

ECM在各种生物医学应用和临床转化中展示了巨大的潜力，并已被广泛应用于组织修复，包括神经修复（Lin等人，2018年；Zou等人，2018年）。ECM是一个复杂的分子网络，调控多种细胞功能，如生长、增殖、迁移、分化和存活。同时，它还在维持细胞稳态中起着关键作用。ECM的组成受特定环境中组织和细胞的影响很大；因此，很难再生出在性质和结构上与天然ECM完全相同的支架。因此，使用容易获得的组织制备的脱细胞ECM可能是最佳模型，可以模拟天然ECM的组成和结构（Hoshiba等人，2016年）。然而，天然组织的稀缺性可能是一个主要限制因素。

在已报道的组织工程技术中，包括局部组织来源、自体组织移植、培养或改良的组织来源移植以及体外或体内完全形成的组织，工程化组织的首选支架仍然是处于天然状态的靶组织ECM（Muschler等人，2004年）。天然ECM满足了干细胞重新接种后成功组织再生所需的关键因素，如材料组成、化学性质和ECM环境。据报道，脱细胞的异体牙髓能够很好地保留ECM结构，在小鼠体内可形成类似牙髓的组织。与自体或异体ECM相比，它具有无限供应的优势（Hu等人，2017年）。

进一步的研究集中在优化脱细胞化方案上，以更好地保留对牙髓再生至关重要的成分，如糖胺聚糖和生长因子（Elnawam等人，2024年）。此外，用牙髓ECM衍生物功能化的生物工程水凝胶已成为有前景的可注射支架，提高了临床操作性，并改善了对细胞存活率和成牙分化的支持（Yuan等人，2023年）。

为了再生功能性牙本质-牙髓复合体，不仅潜在的细胞来源必须能够分化为类似成牙细胞的细胞，植入的干细胞还必须能够分化为神经细胞和内皮细胞，以支持牙髓再生的微环境（Bakhtiar等人，2018年；Lim等人，2021年）。使用牙髓干细胞（DPSCs）可以实现功能性牙髓再生（Nakashima等人，2017年；Shiehzadeh等人，2014年；Xuan等人，2018年）。据报道，临床上每个恒切牙需要2×10^8个细胞才能实现成功的牙髓再生（Xuan等人，2018年）。Nakashima等人（2017年）将DPSCs培养到第7代以获得高产量，满足植入、安全性和质量控制测试的要求。然而，后期传代的细胞容易受到培养条件的影响，这可能会影响牙髓再生的成功率（Kawashima等人，2017年）。由于起始材料的影响，低代次的DPSCs产量较低，因此无法生成所需的细胞数量，这就需要寻找替代方案。

另一种有前景的替代干细胞类型是华通胶间充质干细胞（WJ-MSCs）。华通胶最初由Thomas Wharton在1656年描述，是脐带中羊膜上皮与脐带血管之间的结缔组织（Davies等人，2017年）。自McElreavey及其同事在1991年发现WJ-MSCs以来，它们在再生医学中引起了极大的兴趣（McElreavey等人，1991年）。WJ-MSCs的临床应用非常广泛，包括神经组织、心肌组织、肾脏组织、肝脏组织、肺组织、皮肤组织、肌肉组织、骨骼组织和软骨组织的再生（Abbaszadeh等人，2020年；Stefańska等人，2020年）。WJ-MSCs成功分化为成牙细胞，这激发了它们在牙髓和牙齿再生中的潜力（Li等人，2013年）。与其他间充质干细胞相比，WJ-MSCs作为再生性牙髓学的细胞来源具有优势，因为它们具有更高的分离效率、较高的增殖率、多向分化能力、适合异体移植的免疫调节特性以及非肿瘤性（Abbaszadeh等人，2020年；Stefańska等人，2020年）。

最近的综述进一步强调了WJ-MSCs的临床转化潜力，突出了它们强大的分泌组、促血管生成和神经营养因子特性，以及适合现成细胞库存储的特点（Drobiova等人，2023年；Sharma与Maurya，2024年）。这些特性共同支持了它们作为异体细胞来源用于牙髓再生的应用，尤其是当与脱细胞牙髓基质或牙髓-ECM水凝胶等生物活性支架结合使用时。

据我们所知，本研究是首次将WJ-MSCs作为牙髓再生的潜在干细胞来源，通过用WJ-MSCs重新填充支架来提供三维结构，从而实现牙髓再生。因此，我们旨在提出一种结合可行性、临床可行性和干细胞扩增可行性的创新策略。

牙髓采集和脱细胞化过程

本研究得到了牙科学院伦理委员会DF RD1901/0010(L)的批准。牙髓组织来自从马来亚大学牙科学院正畸诊所就诊的患者中随机收集的拔除的人类恒牙。使用带刺的扩孔器在拔牙后60分钟内取出牙髓组织。所有脱细胞化处理步骤均在室温下进行，并保持轻微搅拌（Song等人描述的方法）。

牙髓组织的成功脱细胞化

通过观察脱细胞化后I型和III型胶原蛋白的丰富程度（图1A）、DNA定量（图1B）和羟脯氨酸检测（图1C），证实了牙髓组织的成功脱细胞化。

细胞脱离的过程如图2A[a-b]和2B[d-e]所示。通过H&E和DAPI染色显示细胞去除情况（图2C[g-h；图2D[j-k）。脱细胞化牙髓的H&E染色也证实了这一过程。

讨论

在推进功能性牙髓再生方面，本研究提出了一种创新策略，将dDP支架与WJ-MSCs结合使用。研究结果表明，成功实现了人牙髓的脱细胞化，同时保留了其重要的ECM成分，并且重要的是，该支架被WJ-MSCs有效重新填充。重新填充的结构表现出向成骨、成牙和神经方向分化的明显倾向，证实了这一策略的潜力。

结论

本研究评估了WJ-MSCs在脱细胞化人牙髓ECM中的重新填充可行性。虽然观察到了成骨倾向，但血管生成相关基因的表达下调表明未来工作中需要解决的关键转化挑战。在考虑临床转化之前，还需要进一步的研究，包括加入血管生成支持、进行机械测试和体内验证。

CRediT作者贡献声明

Nora Sakina Mohd Noor：撰写 – 审稿与编辑、资源准备、方法学设计。 Xin-Jieh Lam：撰写 – 初稿撰写、软件使用、方法学设计、实验设计、数据分析、数据管理。 Abilashini Rajendran：撰写 – 审稿与编辑、方法学设计、实验设计、数据分析、数据管理。 Then Kong-Yong：撰写 – 审稿与编辑、资源获取、资金筹集。 Vijayendran Govindasamy：撰写 – 审稿与编辑、验证工作、监督指导、方法学设计、实验设计、资金筹集、概念构思。

写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本工作时，作者使用了Grammarly工具来改善文本流畅性和语法。使用该工具/服务后，作者根据需要对内容进行了审阅和编辑，并对出版物的内容负全责。

利益冲突

作者声明不存在任何利益冲突。

致谢

本研究是马来西亚大学研究资助计划（资助编号：RF006E-2018）支持的研究项目的一部分，也是马来亚大学牙科学院、CryoCord Sdn Bhd（马来西亚）和Concord Stem Cell Limited（孟加拉国）之间科学研究的合作成果。