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本研究通过RT-qPCR、Western blot等方法，探讨m6A修饰在hBMSCs增殖及成骨分化中的作用机制。结果表明，METTL14和YTHDF3通过m6A修饰调控EPSTI1表达，影响hBMSCs的生物学行为，为骨质疏松治疗提供新靶点。
郑长军|丁玲芝|徐燕|袁驰|姜冰洁|陈婷婷|王永杰
中国浙江省台州市台州大学医院骨科，邮编318000
摘要
背景
骨质疏松症是一种以骨微结构受损和骨量减少为特征的疾病。然而，其分子机制尚未完全明了。
方法
使用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和Western blot（WB）检测信使RNA（mRNA）和蛋白质的表达。流式细胞术用于量化细胞表面标志物。通过细胞转染实现基因敲低和过表达。使用Cell Counting Kit-8（CCK-8）和5-乙炔基-2’-脱氧尿苷（EdU）评估细胞活力和增殖。碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红S（ARS）染色用于评估ALP活性和成骨分化。RNA修饰变异数据库2.0（RMVar 2.0）、RNA修饰碱基数据库3.0（RMbase V3.0）和基于序列的RNA腺苷甲基化位点预测器（SRAMP）用于预测RNA修饰。RNA-蛋白质相互作用（RPI）数据库用于预测RNA-蛋白质相互作用。RNA免疫沉淀（RIP）和甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）用于检测RNA-蛋白质结合和RNA化学修饰。放线菌素D（Act D）用于研究mRNA稳定性。RNA互作组百科全书（ENCORI）用于预测RNA分子之间的相互作用。
结果
上皮-基质相互作用1（EPSTI1）在骨质疏松症中高表达。敲低EPSTI1可促进hBMSC的活力、增殖和成骨分化，而其过表达则产生相反的效果。甲基转移酶样14（METTL14）和YTH N6-甲基腺苷RNA结合蛋白3（YTHDF3）共同调节EPSTI1的N6-甲基腺苷（m6A）修饰。METTL14过表达可增强hBMSC的活力、增殖和成骨分化，但EPSTI1的同步过表达部分抵消了这些促进作用。
结论
METTL14和YTHDF3通过m6A修饰调节EPSTI1的表达，从而影响hBMSC的增殖和成骨分化。
引言
骨质疏松症是一种系统性的代谢性疾病，其特征是骨量下降、骨微结构受损，导致骨骼脆弱性增加（Lane等人，2000年）。这种情况显著增加了骨折的风险，甚至可能导致更高的残疾率和死亡率（Mu?oz等人，2020年；Cairoli等人，2015年）。先前的研究表明，人类骨骼通过一个持续的更新周期维持其完整性：破骨细胞分解现有骨骼，而成骨细胞则重建新骨骼。破骨细胞负责吸收和清除老化骨骼组织，而成骨细胞参与新骨骼的生成和矿化。通过这种动态平衡，骨骼不断更新；然而，骨质疏松症主要是由于破骨细胞活动相对于成骨细胞功能过度，导致骨量和质量下降（De Leon-Oliva等人，2023年；Chai等人，2024年；Xue等人，2023年）。此外，绝经后妇女更容易患骨质疏松症，因为雌激素对于维持骨骼分解和新骨骼生成之间的平衡至关重要。绝经后，雌激素水平下降导致骨骼分解加速，而新骨骼生成减少，从而增加了妇女患骨质疏松症的风险（Cui等人，2024年；Lane，2006年；Zhang等人，2022年；Notelovitz，1997年）。
骨质疏松症仍然是一种无法治愈的慢性疾病（Gosset和Pouillès，2021年），其发病率和残疾率随年龄增长而显著增加，给患者的生活带来了巨大负担（Miller，2016年）。目前，骨质疏松症通过双能X射线吸收测定法（DEXA）进行评估和筛查，以便早期发现骨密度降低；临床治疗通常包括激素疗法、钙和维生素D补充（Prestwood等人，1995年；Kerschan-Schindl，2016年），以及抗吸收和促骨药物如阿仑膦酸钠和特立帕肽（Srivastava和Deal，2002年；Ayers等人，2023年）。然而，这些药物并不能根本治愈骨质疏松症，停药可能导致反弹效应或药物依赖；长期使用还可能带来并发症风险，凸显了现有疗法的局限性。因此，全面研究骨质疏松症的分子基础并识别控制骨代谢的关键通路被认为是开发更安全、更有效疗法的关键。
此外，先前的研究表明，核因子κB受体激活剂（RANK）、核因子κB受体激活剂配体（RANKL）和骨保护素（OPG）通路可以调节破骨细胞分化（Boyle等人，2003年；Cummings等人，2009年；Hadjidakis和Androulakis，2006年），而wingless型（Wnt）/β-连环蛋白通路调节成骨细胞活性，在骨质疏松症的进展中起重要作用（Rong等人，2022年；Ren等人，2025年）。雌激素、睾酮和甲状旁腺激素（PTH）等激素信号被报道会影响骨代谢（V??n?nen和H?rk?nen，1996年；Francis，1999年），炎症细胞因子如白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）调节骨吸收（Wang和He，2020年），为新型靶向疗法的开发提供了理论支持。
人类骨髓间充质干细胞（hBMSCs）是存在于人类骨髓中的一种间充质干细胞，具有多种分化潜能（Pino等人，2012年）。骨质疏松症的发展主要源于成骨细胞介导的骨形成与破骨细胞介导的骨吸收之间的不平衡；当骨形成小于骨吸收时，骨量下降，骨强度减弱，从而更容易发生骨质疏松症（Su等人，2024年）。在骨质疏松症的发展过程中，hBMSC分化为成骨细胞的能力可能会受损，而它们可能更倾向于分化为脂肪细胞，导致骨髓脂肪增加和骨形成减少（Pino等人，2012年）。因此，hBMSC可以在一定程度上反映骨质疏松症的病理特征，在本研究中，hBMSC被用于研究骨质疏松症的分子机制。
尽管如此，骨质疏松症的分子机制尚未完全阐明。基于先前的研究，本研究进一步分析了骨质疏松症背后的分子调控网络，旨在揭示尚未充分探索的通路和关键分子。这项工作旨在为未来的靶向药物开发和个性化治疗策略提供科学基础。
临床样本收集
本研究中使用的骨质疏松性股骨头组织样本及其对应的正常股骨头组织来自台州大学医院（Taizhou Central Hospital）。对应的正常组织取自同一患者在手术过程中股骨头宏观上完整、未骨折的区域。所有患者均接受了DEXA检测，当腰椎（L1–L4）、股骨颈或全髋部的T评分≤–2.5时被诊断为骨质疏松症。
EPSTI1敲低促进hBMSC的成骨分化
RT-qPCR分析显示，骨质疏松症患者的组织中EPSTI1高表达（图1A）。进一步的ROC曲线分析显示AUC值为0.9356，表明EPSTI1可能在骨质疏松症的诊断中具有潜在价值（图1B）。此外，流式细胞术分析显示hBMSC不表达CD34和CD45，而CD90和CD105表达强烈，确认了hBMSC的表型特征，保证了结果的准确性。
讨论
多项研究表明，骨质疏松症主要是由于骨形成不足和骨吸收过度引起的（Eastell和Szulc，2017年；Xie等人，2025年）。作为成骨谱系的前体细胞，hBMSC具有多种分化潜能，可以分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。在骨质疏松症条件下，hBMSC的成骨分化能力下降，而脂肪分化能力增加，从而导致
CRediT作者贡献声明
陈婷婷：监督、项目管理、数据分析、概念构思。王永杰：验证、监督、方法学、数据管理。郑长军：软件应用、方法学、实验设计、数据分析。徐燕：资源获取、项目管理、方法学、数据分析。丁玲芝：数据可视化、监督、方法学。姜冰洁：监督、方法学、数据分析。袁驰：数据可视化、验证、软件应用、实验设计。
伦理审批和参与同意
本研究严格遵循《赫尔辛基宣言》的相关规定和要求。所有参与者均签署了书面知情同意书，并获得了台州大学医院（Taizhou Central Hospital）伦理委员会的批准。
资助
本研究得到了浙江省医学与健康科技计划项目（2025KY1844）和浙江省中医药科技计划项目（2025ZL607）的支持。
