对人类胚胎干细胞的单细胞RNA测序显示，不同细胞亚群对视黄酸介导的效应存在即时和延迟的转录组响应

【字体：大中小】 时间：2026年02月14日 来源：Toxicology in Vitro 2.7

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　　本研究利用单细胞RNA测序技术，评估全反式视黄酸（RA）对H9人胚胎多能干细胞（hPSCs）在 pluripotency 维持期（6/72小时）及定向分化期（14天）的转录组影响。通过对比RA处理与发育轨迹标记物，发现RA显著改变细胞分化轨迹，形成多类型细胞簇群，并揭示其分子作用机制。研究为发育毒性化学的高通量筛选建立了单细胞分辨率生物标志物体系。

作者：Sarah Park、David Gallegos、Susan Jeffay、Alan H. Tennant、E. Sidney Hunter、Brian N. Chorley

美国环境保护署（EPA）研究与发展办公室计算毒理学与暴露中心，北卡罗来纳州研究三角园

摘要

识别化学物质介导的分子特征可以为早期发育过程提供细致的见解，这些过程以可塑性、快速生长和分化为特征。这需要提高对这一阶段存在的多种细胞状态和轨迹的分辨率。基于细胞的模型可以促进对潜在发育毒物的高通量评估和筛选。在这项研究中，我们使用单细胞RNA测序技术来表征H9人类多能干细胞（hPSC）系在维持多能状态的同时，暴露于30 nM全反式视黄酸（RA）（一种必需的维生素A代谢物和潜在的发育形态发生因子）6小时和72小时后的转录组特征。此外，我们还评估了RA在14天内对hPSCs无方向分化过程中的分子影响，以表征与RA相关的细胞转化状态。对于多能状态（6小时和72小时）和无方向分化（14天）的暴露模型，我们都观察到了对RA的转录反应，并将其与改变发育轨迹的标志物进行了比较。在分化培养基中经过14天后，我们观察到了代表多种细胞类型的细胞簇，其发育轨迹因RA暴露而发生了改变。这项研究的总体目标是提供单细胞分辨率数据，这些数据可以应用于未来发育毒物/形态发生因子的化学筛选。

引言

2020年，美国婴儿死亡的主要原因在于先天性畸形（例如大脑/脊柱、眼睛和心脏缺陷），这些缺陷占婴儿死亡的约20%（Ely和Driscoll，2022年）。内在和外在因素的相互作用增加了出生缺陷的风险，这些因素可能包括产前暴露（例如疾病、感染、污染物、辐射、压力和药物）（WHO，2023年）。因此，已经识别出许多发育毒物和致畸物（Grandjean和Landrigan，2014年；Shepard，2010年；Singh等人，2021年；Wolff等人，2017年），但还有许多化学物质尚未被评估和表征。使用模式生物（如啮齿动物、斑马鱼和无脊椎动物）的研究产生了有关发育毒性的信息，但在潜在的人类发育干扰物的筛选、识别、表征和优先排序方面，可扩展性是一个关键问题。新的方法或NAMs（New Approaches to Assessment），利用基于细胞的评估（体外）和/或物理化学（化学）及计算（计算机模拟）模型（美国国家科学院和医学院，2023年；Paul Friedman等人，2025年），可以用于筛选化学物质并预测其毒性。NAMs的优势，特别是体外模型，包括可扩展性、设计可调性、研究间的协调性、高效性、高产量输出以及使用人类来源的细胞和组织（Schmeisser等人，2023年）。其中一种能够弥合可扩展性和可转化性差距的体外模型是人类多能干细胞（hPSCs）。

在早期发育事件的背景下，人类多能干细胞（hPSCs）已被广泛用于评估发育过程，包括胎盘形成（Morey等人，2023年）、胚泡形成和/或细胞谱系的分化和指定（Gamble等人，2022年；Hoang等人，2022年；Saili等人，2020年；Zurlinden等人，2020年）。hPSCs能够捕捉并表征多种细胞类型的化学介导效应，以及它们的分化和增殖潜力或轨迹（Kameoka等人，2014年），包括在暴露于已知形态发生因子时的情况（Saili等人，2020年）。然而，识别确定的正面和负面参考发育毒物的总体准确性仍约为80%（Piersma等人，2022年）。评估单个细胞及其相互作用可能有助于详细和可控地探究分子机制，这对于理解化学暴露如何破坏早期发育过程中异质性的细胞轨迹和速度至关重要（Knudsen等人，2021年）。

单细胞转录组分析提供了关于单个细胞的高分辨率分子见解。单细胞RNA测序（scRNA-seq）是一种有价值的工具，可以精确地了解细胞何时以及如何做出决策和方向；它还有助于发现其他方法无法检测到的但对刺激敏感的细胞类型，这些特征对于发育毒效学分析非常重要，但使用批量或聚合转录组方法可能无法发现（Knudsen等人，2021年）。例如，在我们最近使用人类肝细胞系的研究中，我们利用scRNA-seq更好地量化了细胞对急性毒物暴露的反应，以便使用特定于肝脏毒性的NAMs模型来更好地了解化学物质的作用机制（Shah等人，2025年）。在发育背景下，scRNA-seq可以提供潜在化学介导的转录变化的细胞级分辨率，并可能识别出可以通过细胞表征来评估的形态发生作用或时序的异质性（Knudsen等人，2021年）。在发育过程中，从细胞同质性到有机体级复杂性的转变发生得非常迅速，因为细胞迅速分裂、分化并连接形成组织和器官；这是一个在空间和时间上受到严格调控的过程。scRNA-seq已被用于检测和描绘由于化学暴露引起的这些早期和微妙的改变（Guo等人，2019年；Knudsen等人，2021年）。它可以作为一种工具来追踪分子信号或潜在的改变的发育轨迹，明确细胞类型和状态，并生成指示发育毒性的预测性生物标志物，从而加强体外与体内的比较。这些毒效学特征可以用于识别潜在的发育毒物，并支持在监管决策中使用NAMs（Baker等人，2023年；Harrill等人，2021年；Knudsen等人，2021年；Piersma等人，2022年；Shah等人，2025年）。最近的监管指南反映了在发育和其他毒理学终点评估中越来越多地使用基于细胞和分子的NAMs（美国国家科学院和医学院，2023年；OECD，2023年）。

在这项研究中，我们利用scRNA-seq的分辨率来表征早期胚胎发生过程中的短期暴露介导的分子特征。我们试图识别可能与发育毒物相关的生物标志物，这些标志物可以用于高通量化学筛选，从而提高基于细胞的模型的预测准确性。为此，我们将hPSC细胞系（H9）暴露于全反式视黄酸（RA）6小时和72小时，并使用scRNA-seq来定义多能/祖细胞状态下的RA调节的转录组谱型。尽管RA是维生素A的天然衍生物，是细胞生长、成熟和发育所必需的营养素，但在某些情况下，它也是一种公认的泛发育形态发生因子和致畸物（Ghyselinck和Duester，2019年；Palmer等人，2017年；Piersma等人，2017年；Ross等人，2000年）。此外，我们还评估了RA对H9s无方向分化14天的影响，以阐明与未处理细胞相比可能增强或减弱的RA介导的细胞状态和分子途径。这些特征可能适用于作为潜在发育毒物的靶向分子评估。

材料与方法

本研究中使用的试剂的制造商、目录和批次信息见补充表S1。研究执行的简化示意图见补充图S1。

细胞活力和形态

通过在处理后的分离H9细胞中应用AOPI染色来确定细胞活力，在6小时（平均分别为95.2%和95.8%）或72小时（平均分别为95.7%和97.6%）时，对照组和RA处理组之间没有差异。从质量上看，明场图像显示了几乎没有分化的细胞群（其特征是扁平的立方体形态；图S2）。免疫荧光成像显示，在72小时时主要是多能细胞。

讨论

随着细胞脱离多能状态并向各种细胞谱系分化，发育过程得以进行（Miyamoto等人，2015年）。基因表达的时间和程度是正常发育的关键因素。通过使用经典的发育形态发生因子视黄酸（Duester，2008年）和人类多能干细胞，可以研究化学扰动如何调节细胞

结论

这项研究提供了一个案例研究，展示了如何使用单细胞RNA测序来表征早期发育过程中毒物介导的转录特征，这一时期以快速生长和分化为特征。未来的研究可以考虑在6小时到14天之间增加更多的时间点，以提高对定向发育过程中模糊或短暂细胞状态的分辨率，并扩展对其他化学物质的分析，这些化学物质既具有共同的特征，也具有独特的特征

作者贡献

所有列出的作者都对这项工作做出了实质性、直接和智力上的贡献，并批准其发表。SP：概念化、正式分析、撰写——初稿、撰写——审阅和编辑。DG：概念化、方法学、软件、数据管理、正式分析、调查、数据管理、可视化、撰写——初稿、撰写——审阅和编辑。SJ：验证、调查。AT：方法学、软件、数据管理、正式分析

CRediT作者贡献声明

Sarah Park：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、正式分析、概念化。David Gallegos：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、可视化、软件、方法学、调查、正式分析、数据管理、概念化。Susan Jeffay：验证、调查。Alan H. Tennant：撰写——审阅与编辑、可视化、软件、方法学、正式分析、数据管理。E. Sidney Hunter：撰写——审阅与编辑、监督

免责声明

本文描述的研究已经过美国环境保护署（EPA）的审查并获准发表。批准并不表示内容必然反映该机构的观点和政策。提及商标名称或商业产品并不构成使用推荐。

资助

本研究的资金由美国环境保护署（US EPA）研究与发展办公室提供。

利益冲突声明

作者声明以下财务利益/个人关系可能被视为潜在的利益冲突：

Brian Chorley是《Toxicology In Vitro》杂志的编委会成员。他没有参与本文的同行评审，也无法获取有关其同行评审的信息。本文的编辑过程的全部责任由另一位期刊编辑负责。如果还有其他作者，他们声明自己没有已知的利益冲突

致谢

作者感谢Imran Shah博士、Colette Miller博士、John Cowden博士、Katie Paul-Friedman博士和Alison Harrill博士对本手稿的技术审查和建设性评论。特别感谢国家环境卫生科学研究所的Jason Malphurs、Michelle Campbell博士、Brian Papas博士和Suzanne Martos博士在测序协助和样本制备方面的帮助。

术语表

RA
BSA
cDNA
DAPI
DEGs
DMSO
DPBS
DSigDB
ECM
EMT
FDR
GEMs
GFP
GLM
GO
hPSCs
kNN
MAST

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