GCN2/eIF2α信号通路在MC-LR诱导的肝细胞氧化损伤中的作用及α-硫辛酸的干预机制

本研究探讨α-硫辛酸（α-LA）通过抑制ROS介导的GCN2/eIF2α通路减轻微囊藻毒素-LR（MC-LR）诱导肝细胞氧化损伤的机制。实验采用人及小鼠肝细胞模型，通过分组干预发现α-LA预处理可有效降低MC-LR引起的ROS水平，抑制GCN2/eIF2α通路激活，改善肝细胞氧化损伤，为开发抗MC-LR药物提供依据。

　　

艾琳·谭 | 余 黄 | 沈 漫云 | 陈 朝阳 | 张 清碧 | 白 俊 | 罗 亮平 | 江 学莲 | 李 瑞霞 | 韩 志霞

中国泸州西南医科大学公共卫生学院，646000

摘要

先前的研究表明，α-硫辛酸（α-LA）可以保护肝脏免受微囊藻毒素-LR（MC-LR）的毒性作用，尽管其确切机制尚未完全明确。本研究旨在阐明活性氧（ROS）介导的GCN2/eIF2α通路如何使α-LA减轻MC-LR引起的肝细胞氧化损伤，从而为揭示MC-LR诱导的细胞损伤机制及寻找新的预防和治疗方法提供坚实的科学基础。为此，将人类正常肝细胞（L02细胞）和小鼠正常肝细胞（AML12细胞）分为十组：空白对照组、1 μM MC-LR处理组、50 μg/mL α-LA处理组、联合MC-LR和α-LA处理组、siGCN2处理组、GCN2抑制剂（GCN2iB）处理组，以及同时接受1 μM MC-LR和siGCN2或GCN2iB处理的组。研究发现，MC-LR会降低SOD活性、升高MDA水平、降低线粒体膜电位并刺激ROS生成，最终导致细胞氧化损伤。MC-LR通过促进ROS激活GCN2/eIF2α通路，进而引起细胞氧化损伤。此外，应用抑制剂或抑制GCN2活性可以减少ROS生成，从而减轻MC-LR引起的肝细胞氧化损伤。α-LA预处理可增强AML12细胞和L02细胞的抗氧化能力，并缓解MC-LR引起的氧化应激（OS）。这表明α-LA可以在一定程度上保护AML12细胞和L02细胞免受MC-LR的氧化损伤，其机制可能是通过抑制GCN2/eIF2α通路实现的。

引言

生物营养素（氮和磷）的积累是淡水“藻华”的主要原因（Chen等人，2017；Lin等人，2018）。蓝藻藻华会释放大量蓝藻毒素，其中MC-LR的毒性最强，具有强烈的肝毒性和致癌性（IARC 2B类）（Humans，2010；McLellan & Manderville，2017；Yan等人，2022）。急性暴露可能导致肝损伤甚至死亡，长期暴露会增加患肝癌的风险（Massey等人，2018）。MC-LR可通过多种途径进入人体，且化学性质稳定，难以降解（Major等人，2018）。世界卫生组织规定饮用水中MC的浓度应≤1μg/L，但中国许多湖泊的浓度超过了这一标准（“WHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee”，2022）。因此，微囊藻毒素污染对人群健康构成威胁，需要加强相关预防和控制措施的研究。

微囊藻毒素（MCs）的毒性机制复杂，主要涉及干扰细胞信号通路、引发氧化应激、影响遗传物质和器官功能。MCs可通过复杂机制诱导活性氧（ROS）的产生，从而引发氧化应激。ROS水平升高会导致细胞内Ca²⁺浓度增加，进而触发线粒体通透性转变（MPT），破坏线粒体膜电位，并进一步促进ROS生成，形成恶性循环。线粒体功能受损后，会释放促凋亡因子（如Bax和Bid），最终导致细胞凋亡或坏死（Shi等人，2021）。

通用控制因子2（GCN2）是一种真核细胞起始因子2α（eIF2α）激酶，在细胞应激时被激活并调节蛋白质合成（Zhang等人，2020）。Wang等人（Wang等人，2016）发现ROS水平升高会激活GCN2并促进eIF2α磷酸化，而抗氧化剂可以逆转这一过程。Gao等人（Gao等人，2021）表明MC-LR通过ROS激活GCN2/eIF2α通路，GCN2iB可显著抑制这一过程，而自由基清除剂则不影响GCN2/eIF2α通路。这表明GCN2通路与氧化损伤有关，微囊藻毒素可以激活该通路。因此，本研究推测微囊藻毒素可能通过增强ROS生成和激活GCN2通路来诱导肝细胞氧化应激。

α-硫辛酸（α-LA）是一种天然且强效的抗氧化剂，化学名为1,2-二硫烷-3-戊酸。它通过中和自由基并恢复线粒体中的电子，转化为DHLA（二氢硫辛酸），从而协同增强自由基清除和脂质过氧化抑制作用（Bj?rklund等人，2019；Durand & Mach，2013；Huk-Kolega等人，2011）。1）α-LA通过螯合Fe²⁺或阻止VitC将Fe³⁺还原为Fe²⁺，减少Fe²⁺引起的DNA损伤和脂质过氧化。2）α-LA直接清除ROS，并通过减少谷胱甘肽、维生素C和E间接增强抗氧化网络，减轻氧化应激。DHLA可减少α-LA的氧化产物beta-LA，增强协同抗氧化作用。3）α-LA降低肽甲硫氨酸亚砜还原酶活性，间接修复氨基酸氧化损伤，并维持生物分子的稳定性（Durand & Mach，2013；Gor?ca等人，2011）。总之，α-LA和DHLA构成一个复杂的抗氧化系统，通过多种途径保护细胞免受氧化损伤。

鉴于MC-LR会引发氧化应激、加速ROS生成、诱导DNA损伤并可能促进细胞恶性转化，本研究认为α-LA的抗氧化特性可能对抗MC-LR在肝细胞中引起的氧化损伤。这种缓解作用可能是通过减少ROS生成和抑制GCN2/eIF2α通路来实现的，从而纠正氧化还原失衡并改变细胞微环境。为了验证这一假设，我们建立了使用α-LA的体外细胞模型，模拟急性MC-LR毒性，结合分子生物学技术评估AML12和L02细胞中的氧化损伤，并分析与GCN2/eIF2α通路相关的蛋白质和基因表达，以加深对α-LA抗MC-LR诱导的肝细胞氧化损伤的化学保护作用的理解。

MC-LR及其试剂

纯度≥95%、分子量为995.2的MC-LR购自中国北京的Puhuashi公司。纯度≥99%、分子量为206.32的α-LA购自中国上海的Sigma-Aldrich公司。Cell Counting Kit-8（CCK-8）购自美国APExBIO公司，ROS检测试剂盒购自中国上海的Biyuntian Biotechnology公司。线粒体膜电位（JC-1）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒由Solarbio公司提供。

α-LA对AML12和L02细胞中MC-LR诱导的细胞活力的影响

图1显示，与正常对照组相比，暴露于MC-LR的AML12和L02细胞的活力显著降低（P < 0.01），表明MC-LR具有显著的细胞毒性。相反，用10、25和50 μg/mL α-LA处理后，这两种细胞的存活率显著提高（P < 0.01），说明α-LA对MC-LR引起的细胞损伤具有保护作用。

α-LA预处理对MC-LR诱导的GCN2/eIF2α通路激活的抑制作用

利用蛋白质印迹技术评估了相关蛋白的表达水平

讨论

随着全球蓝藻藻华的增多，微囊藻毒素（尤其是MC-LR）的存在对健康构成了重大风险。由于其稳定性和高毒性，MC-LR容易通过受污染的饮用水和食物链在人体内积累，与肝癌风险增加密切相关。传统的水处理方法难以有效降解MC-LR。然而，研究表明，外源性抗氧化剂（如大蒜）

结论

我们的研究表明，MC-LR通过促进ROS生成激活AML12和L02细胞中的GCN2/eIF2α通路，从而引发氧化应激。相反，α-LA对这种氧化损伤具有保护作用，通过调节GCN2/eIF2α通路显著减轻了MC-LR的效应。本研究为理解ROS在GCN2/eIF2α通路激活中的作用奠定了实验基础，并阐明了α-LA的作用机制。

CRediT作者贡献声明

白 俊：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源管理、项目管理、方法学设计、数据分析、数据整理。张 清碧：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、监督、资源管理、方法学设计、资金获取、数据分析、概念构建。江 学莲：撰写 – 审稿与编辑、监督、软件使用、项目管理、方法学设计、实验实施、数据整理。罗 亮平：撰写 – 审稿与编辑

未引用的参考文献

Durand和Mach，2013；Gold和Masson，2022；McLellan和Manderville，2017；WHO Guidelines Approved by the Guidelines Review Committee，2022。

伦理批准

本文未涉及任何人类或动物作为实验对象。

参与同意

所有作者均自愿参与本研究。

发表同意

所有作者均同意发表本文。

数据和材料的获取

本研究生成或分析的所有数据可向相应作者索取。

资金支持

本研究得到了泸州市人民政府和西南医科大学的科技战略合作项目（编号LZXNYD-ZK09）以及大学生创新创业培训项目（S202510632161、S202410632219）的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。