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牛病毒性腹泻病毒-1（BVDV-1）存在细胞病变型（CP）和非细胞病变型（NCP）两种表型，均通过上调PD-1和PSGL-1表达抑制免疫应答。本研究利用小鼠模型比较两种表型对PD-1/PSGL-1介导的免疫抑制机制差异，发现CP感染中单抗阻断PD-1或PSGL-1即可逆转免疫抑制，而NCP感染需双阻断，表明PSGL-1在NCP中依赖PD-1信号协同作用。该机制揭示BVDV-1免疫逃逸的双通路调控模式，为疫苗研发和靶向免疫治疗提供理论依据。
杨丽|宋旭新|何琳茹|李佩龙|陈若思|孙明月|周玉龙|张泽才|刘珊珊|赵建军|朱展博|刘宇
黑龙江省八一农业大学动物科学与 Veterinary Medicine 学院，大庆 163319，中国
摘要
牛病毒性腹泻病毒-1（BVDV-1）最近被重新分类为 Pestivirus bovis，它存在细胞病变型（CP）和非细胞病变型（NCP）两种生物型，并由于免疫抑制作用导致显著的经济损失。然而，特定免疫检查点在 BVDV 病理发生中的作用仍不清楚。本研究探讨了程序性死亡-1（PD-1）和 P-选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1）在 CP 和 NCP BVDV 感染小鼠模型中的免疫调节功能。这两种生物型均上调了外周血淋巴细胞和 CD8? T 细胞上的 PD-1 和 PSGL-1 表达，导致白细胞减少、淋巴细胞减少、增殖受损、IFN-γ 分泌减少、凋亡增加以及病理损伤。在 CP BVDV 感染中，单独或联合阻断 PD-1 或 PSGL-1 可以增加白细胞计数，增强 CD8? T 细胞的活化和增殖，减轻病理损伤，并抑制病毒复制，同时激活 PI3K/Akt/mTOR 通路。在 NCP BVDV 感染中，单独阻断 PSGL-1 无效，只有通过联合阻断 PD-1/PSGL-1 才能显著改善免疫状态，表明 PSGL-1 在 NCP BVDV 感染中具有依赖 PD-1 的作用。从机制上看，PSGL-1 在 CP BVDV 感染中表现出类似免疫检查点的活性，而在 NCP 感染中则作为依赖于 PD-1 信号的共调节因子。这些发现揭示了一种新的、具有生物型特异性的免疫检查点调节机制，为针对牛 BVDV 感染的生物型定制免疫调节策略提供了理论基础。
引言
牛病毒性腹泻病毒-1（BVDV-1）根据国际病毒分类委员会（ICTV）的规定，目前被命名为 Pestivirus bovis，是 Flaviviridae 科 Pestivirus 属的重要成员。它是全球范围内感染牛的重要病原体，由于生殖失败、黏膜疾病、持续性感染（PI）和免疫抑制等原因造成重大经济损失（Le 等，2022；Wang 等，2021）。BVDV-1 的一个关键生物学特征是存在两种生物型：细胞病变型（CP）和非细胞病变型（NCP）。NCP 生物型是胎儿中建立持续感染的核心因素，这对病毒的流行病学至关重要，并且是导致致命黏膜疾病的毒力 CP 菌株的储存库（Yuting 和 Feng，2024）。这两种生物型都具有强烈的免疫抑制作用，会损害先天性和适应性免疫（Chase 等，2015）；然而，驱动这种免疫抑制的精确分子机制，特别是关键效应细胞（如 CD8? T 细胞）的功能障碍，仍不完全清楚。
T 细胞耗竭是许多慢性病毒感染的标志，其特征是效应功能的逐渐丧失和多种免疫检查点分子（包括程序性死亡-1（PD-1）的持续表达（Baessler 和 Vignali，2024）。阻断 PD-1/程序性死亡配体 1（PD-L1）轴已成为慢性病毒感染和癌症的革命性免疫疗法（Barber 等，2006；Sharpe 和 Pauken，2018）。在人类免疫缺陷病毒（HIV）、丙型肝炎病毒（HCV）、经典猪瘟病毒（CSFV）和牛白血病病毒（BLV）的感染中，抗体介导的 PD-1 通路阻断已被证明可以改善淋巴细胞功能、抑制病毒复制并减少淋巴细胞凋亡（Barathan 等，2017；Okagawa 等，2023；Okagawa 等，2017；Velu 等，2015；Yue 等，2014）。我们的初步研究还发现，与 NCP BVDV-1 感染期间相比，PD-1 阻断在 CP BVDV-1 感染期间对改善 CD8? T 细胞的活化和增殖有更明显的影响，这可能与其对 PI3K/Akt/mTOR 和 ERK 信号通路的差异性作用有关（Li 等，2025；Liu 等，2021）。
P-选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1）最初被鉴定为白细胞粘附分子，但最近被认作另一种免疫检查点（Tinoco 等，2016）。PSGL-1 在 T 细胞上高度表达，可以与多种配体相互作用，从而影响 CD4? 和 CD8? T 细胞的分化和功能（DeRogatis 等，2021；Hope 等，2023）。它参与肿瘤微环境可能会促进有利于肿瘤生长的 CD4? 和 CD8? T 细胞耗竭途径。此外，PSGL-1 可以与 PD-1 共同作用，抑制 T 细胞增殖和细胞因子产生，尤其是在慢性病毒感染和炎症环境中（Tinoco 等，2016；Viramontes 等，2022；Viramontes 等，2025）。基于我们的初步发现以及 PD-1 和 PSGL-1 在慢性病毒感染和肿瘤中的已知作用，我们假设 PD-1 和 PSGL-1 通路可能在 BVDV-1 感染期间介导免疫失调中发挥关键作用。鉴于 CP 和 NCP 生物型具有不同的生物学行为和疾病结果，我们推测它们与宿主免疫检查点机制的相互作用也可能存在显著差异。
尽管 BVDV-1 诱导的免疫抑制已有充分记录，但在 CP 和 NCP BVDV-1 感染背景下特定免疫检查点分子的相对作用仍需进一步探索。这一知识空白阻碍了靶向免疫调节策略的发展。在本研究中，我们特别使用了 CP BVDV-1a 菌株 NADL 和 NCP BVDV-1b 菌株 NY-1。这些菌株代表了全球普遍存在且具有临床意义的亚型，使我们能够在影响全球牛群的主要 BVDV 物种背景下研究免疫检查点的调节。我们的研究旨在系统地分析 PD-1 和 PSGL-1 通路在 CP 和 NCP BVDV-1 感染模型中对免疫功能障碍的单独和联合贡献。具体来说，我们使用了 BVDV-1 感染的小鼠模型。该模型提供了一个可控的、基因定义明确的、实验可行的系统，用于研究系统性的免疫检查点动态，这在牛身上难以从机制上进行研究。这种方法的有效性得到了利用小鼠模型定义病毒感染中免疫检查点生物学基本原理的成功案例的支持（Barber 等，2006），以及我们之前关于该模型研究 BVDV-1 诱导的 PD-1 介导的免疫抑制的相关性的工作（Liu 等，2021）。我们试图阐明这两种生物型感染期间 PD-1 和 PSGL-1 在关键免疫细胞（如 CD8? T 细胞）上的动态表达。我们评估了这种表达对淋巴细胞稳态、活化、增殖、细胞因子产生和凋亡的功能后果。此外，我们分析了单独或联合阻断这些通路的治疗潜力，以改善免疫能力并减轻病理损伤。我们还研究了下游信号事件（如涉及 AKT/mTOR/ERK 的事件），以揭示潜在机制。本研究的结果为探索生物型定制的免疫治疗干预措施提供了基础，特别是针对 PD-1/PSGL-1 通路的策略，这可能是一种有前景的方法，可以逆转免疫耗竭、增强病毒清除，并最终帮助控制这种具有经济破坏性的病原体。
章节片段
伦理声明
该研究方案已获得黑龙江省八一农业大学机构动物护理和使用委员会的批准（批准号 DWKJXY2024012），并按照《农业动物在研究和教学中的护理和使用指南》进行。本研究的报告符合 ARRIVE 2.0 动物研究报告指南。
动物实验
我们根据之前的研究（Liu 等，2021）建立了 BVDV-1 感染的小鼠模型。
BVDV-1 感染小鼠中 PD-1 和 PSGL-1 mRNA 及蛋白的表达增加
我们确认，在感染后第 7 天，BVDV-1 显著上调了 PBL 中的 PD-1 mRNA（CP，p < 0.0001；NCP，p < 0.001；图 1A）和蛋白（CP，p < 0.0001；NCP，p < 0.001；图 1C）水平。同样，感染小鼠的 PBL 中 PSGL-1 mRNA（CP，p < 0.001；NCP，p < 0.01；图 1B）和蛋白（CP，p < 0.001；NCP，p < 0.01；图 1D）的表达也显著升高。与此一致，PD-1 和 PSGL-1 蛋白的表达在 CD8? T 细胞中也显著增加。
讨论
本研究发现，CP 和 NCP BVDV-1 感染均显著上调了 PBL 和 CD8? T 细胞中的 PD-1 和 PSGL-1 表达。这一发现与慢性病毒感染中免疫检查点上调的一般模式一致。例如，在 HIV 和 BLV 感染中，PD-1 和 PSGL-1 在耗竭的 T 细胞上的高表达与病毒载量和疾病进展相关（Ikebuchi 等，2013；Zaongo 和 Chen，2023）。值得注意的是，检查点分子的
结论
总之，本研究阐明了 PD-1 和 PSGL-1 在 CP 和 NCP BVDV-1 感染中的不同免疫调节作用。CP BVDV-1 诱导的免疫检查点环境中，PD-1 和 PSGL-1 独立地导致 CD8? T 细胞功能障碍，而 NCP BVDV-1 建立了一个更紧密整合的抑制网络，需要双重检查点阻断（补充图 S2）。这些发现揭示了 Pestivirus bovis 感染期间免疫检查点调节的一种新的、具有生物型特异性的机制。
资助
本研究得到了中国国家自然科学基金（32573407）、黑龙江省自然科学基金（PL2024C024）和黑龙江省高校学科协同创新成果项目（LJGXCG2024-F07）的支持。
CRediT 作者贡献声明
张泽才：验证、软件、方法学。刘珊珊：方法学、正式分析。赵建军：验证、监督、软件。朱展博：写作 – 审稿与编辑、监督、资金获取。刘宇：写作 – 审稿与编辑、验证、方法学、资金获取。杨丽：写作 – 初稿、方法学、正式分析、数据管理。宋旭新：方法学、正式分析、数据管理。何琳茹：方法学、调查、正式分析。李佩龙：利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
