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《Applied and Environmental Microbiology》：Carbonic anhydrases contribute to mitochondrial function, conidial development, and pathogenicity of Magnaporthe oryzae

（编辑推荐）本研究发现稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）线粒体碳酸酐酶家族（MoCAs）成员MoCA2、MoCA4、MoCA6与MoCA1互作，不仅协同调控分生孢子发育与致病性，还通过影响线粒体膜电位、ATP合成以及谷氨酰胺（Gln）-谷氨酸（Glu）氮代谢通路来维持细胞内pH稳态，为靶向CA家族开发新型稻瘟病防治策略提供了重要理论依据。

　　

碳酸酐酶（CA）家族在真菌生命活动中的多重作用

碳酸酐酶（CAs）是广泛存在于生物系统中的金属酶，能够催化二氧化碳（CO₂）可逆水合生成碳酸氢根（HCO₃^-）和质子（H⁺），这一反应在维持酸碱平衡、CO₂转运、细胞代谢等众多生理过程中至关重要。本研究聚焦于引起全球水稻生产重大损失的稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae），深入探究了其线粒体中多个碳酸酐酶（MoCAs）的功能。

线粒体定位与蛋白互作网络

研究首先通过构建DsRED标记的融合蛋白，对MoCA2、MoCA4和MoCA6进行了亚细胞定位分析，结果显示它们与线粒体标记物Mito-Tracker Green共定位，证实它们与先前已报道的MoCA1一样，均定位于稻瘟病菌的线粒体中。进一步通过酵母双杂交（Y2H）和双分子荧光互补（BiFC）实验，证明了MoCA1与MoCA2、MoCA4、MoCA6在线粒体内存在直接的蛋白-蛋白相互作用，揭示了线粒体CA家族成员之间形成了一个功能互作网络。

功能协同性与酶抑制剂敏感性分析

为了探索这些MoCAs的功能，研究团队构建了相应的基因敲除突变体ΔMoCA2、ΔMoCA4和ΔMoCA6。在含有碳酸酐酶抑制剂乙酰唑胺（Ace）的培养基上培养时，这些敲除突变体与ΔMoCA1一样，生长均受到显著抑制，而野生型菌株受影响较小。这一表型证实了这些基因编码的蛋白确实具有CA活性。定量PCR分析发现，当敲除一个MoCA基因时，其他MoCA基因的表达水平会发生代偿性变化，尤其是在ΔMoCA6背景中其他基因表达下调显著，而MoCA6在其他突变体背景中表达则显著上调，这强烈暗示了MoCA家族成员之间存在功能协同与补偿机制，其中MoCA6可能处于调控网络的核心位置。

对分生孢子发育与附着胞形成的调控

在真菌的无性繁殖阶段，MoCAs发挥着关键作用。与野生型和基因回补菌株相比，ΔMoCA2、ΔMoCA4和ΔMoCA6突变体产生的分生孢子梗和分生孢子数量均显著减少。此外，突变体分生孢子的萌发率和附着胞的形成率也明显降低，并且形成的附着胞畸形率显著升高。通过甘油渗透压实验检测附着胞的膨压发现，突变体附着胞的崩溃率显著高于对照，表明其侵染结构的机械穿透能力受损。这些结果表明，MoCA2、MoCA4和MoCA6共同参与调控稻瘟病菌分生孢子的正常发育以及具有高膨压的、功能完整的附着胞的形成。

致病性严重受损

致病性试验进一步证实了这些基因的重要性。无论是采用孢子悬浮液喷雾接种水稻叶片，还是注射接种水稻叶鞘，ΔMoCA2、ΔMoCA4和ΔMoCA6突变体引起的病斑面积和菌丝在寄主细胞内的扩展能力均显著弱于野生型和回补菌株。在叶鞘侵染实验中，根据侵染菌丝（IH）的发育形态将其分为四种类型进行量化统计，结果显示突变体在侵染早期（24小时）形成初级侵染菌丝的比例就显著降低，并且在72小时内扩展至邻近细胞的能力也严重不足。这些数据综合表明，MoCA2、MoCA4和MoCA6是稻瘟病菌完全致病性所必需的。

线粒体功能障碍与ATP合成受损

鉴于MoCAs定位于线粒体，研究深入探讨了它们对线粒体功能的影响。使用JC-1荧光探针检测线粒体膜电位（MMP）发现，ΔMoCA2、ΔMoCA4和ΔMoCA6突变体的分生孢子中，标志线粒体功能正常的红色荧光强度显著降低，而代表膜电位去极化的绿色荧光增强，其红绿荧光比值大幅下降，甚至低于野生型的一半，这表明敲除MoCA基因导致了线粒体早期凋亡状态。线粒体是细胞的“动力工厂”，是ATP合成的主要场所。检测发现，突变体菌丝内的ATP含量显著降低。同时，与ATP合成相关的多个基因（如ATP合酶α、β亚基，以及线粒体编码的M4、M9亚基基因）的表达水平在突变体中均显著下调。这些结果揭示，线粒体CA家族通过协同作用，对维持正常的线粒体膜电位和驱动ATP合成至关重要。

参与谷氨酰胺-谷氨酸氮代谢通路

氮代谢对于真菌在养分多变的宿主环境中的生存和致病至关重要。通过KEGG数据库预测和实验验证，研究发现MoCAs与氮代谢密切相关。在缺乏氮源（MM-N）的培养基上，ΔMoCA突变体的生长抑制比野生型更为严重。然而，当以谷氨酰胺（Gln）或谷氨酸（Glu）作为唯一氮源时，突变体的生长能力得到恢复甚至增强，提示MoCAs可能特异性参与Gln-Glu代谢途径。对几个关键的氮代谢相关基因（如硝酸盐还原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸脱氢酶相关基因）的表达分析显示，在ΔMoCA突变体中，这些基因的表达普遍受到显著下调。这证明MoCA2、MoCA4和MoCA6不仅独立作用于Gln-Glu代谢，还与其他基因协同调控整个氮代谢网络。

讨论与展望：维持pH稳态的核心角色

综合以上发现，本研究提出了一个关于稻瘟病菌线粒体CA家族功能的整合模型。这些Zn2?依赖的CA（MoCA2为α型，MoCA1、MoCA4、MoCA6为β型）在线粒体内形成互作网络。它们通过催化CO₂水合反应，在线粒体基质中产生HCO₃^-和H⁺。一方面，产生的H⁺可能直接为线粒体呼吸链复合物I（Complex I）的质子泵提供来源，或优化ATP合酶周围的质子浓度，从而驱动高效的氧化磷酸化（OXPHOS）和ATP生成。另一方面，HCO₃^-作为底物或辅助因子，参与包括Gln和Glu合成在内的多种生物合成途径。通过协调ATP合成（能量代谢）和Gln-Glu代谢（氮代谢），CA家族共同维持了细胞（特别是线粒体）内部的pH稳态和代谢平衡。这种内稳态的维持，对于稻瘟病菌应对宿主细胞内低氮、高HCO₃^-和缺氧等多种环境胁迫，并成功完成分生孢子发育、附着胞形成及侵染菌丝扩展等致病过程，是不可或缺的。

结论

本研究系统阐明了稻瘟病菌线粒体碳酸酐酶家族成员MoCA2、MoCA4和MoCA6在真菌生长发育和致病机制中的关键作用。它们通过蛋白互作形成功能协同网络，不仅直接调控无性繁殖和侵染结构形成，更深层次地通过影响线粒体功能、ATP合成以及谷氨酰胺-谷氨酸氮代谢通路，来维持细胞内的pH稳态与代谢稳定。这些发现不仅深化了对植物病原真菌适应宿主环境分子机制的理解，更重要的是，将碳酸酐酶家族确立为防治稻瘟病的一个富有潜力的新型药物靶点，为开发基于CA抑制剂的新型绿色农药提供了重要的理论依据和新的思路。