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本综述通过对百日咳博德特菌PlrSR双组分系统（TCS）六基因簇的深入解析，首次提供了遗传证据，表明周质蛋白PlrP是PlrSR系统的第三组分，并通过抑制PlrS的磷酸酶活性，调控PlrR的磷酸化水平，从而影响细菌在下呼吸道（LRT）的生存。这一发现不仅揭示了PlrP在PlrSR信号转导中的核心作用，也为理解NtrYX家族TCS在其他β-和γ-变形菌中的功能提供了新视角，为相关病原菌的防控策略提供了潜在靶点。
引言
百日咳博德特菌等经典博德特菌是β-变形菌，能在广泛的环境和真核生态位中生存。其中，百日咳博德特菌是百日咳（whooping cough）的病原体，尽管疫苗接种率较高，但全球百日咳病例仍在上升，需要更好的疫苗策略。所有已知的百日咳蛋白毒力因子编码基因均由双组分调节系统（TCS）BvgAS调控，BvgAS被认为是“主毒力调节因子”。然而，2011年发现的另一个TCS——PlrSR，被证明是百日咳博德特菌在下呼吸道（LRT）持续生存所必需的。PlrSR属于NtrYX家族TCS，广泛分布于变形菌中，参与调节氮代谢、细胞包膜过程、呼吸酶和铁稳态等过程。
PlrSR位于一个具有类操纵子结构的六基因簇中
PlrSR基因位于六个同向转录基因簇的中间（BB0262–BB0267）。在plrS上游有两个基因：rsmB（预测编码rRNA甲基转移酶）和plrP（预测编码一个含有未知功能域（DUF4390）的蛋白）。plrSR下游的两个基因trkA和trkH预测编码钾离子转运蛋白。这些基因的排列方式提示它们可能形成一个操纵子。
RsmB、PlrP和PlrSR在β-和γ-变形菌中共同定位
通过比较12种细菌物种（包括百日咳博德特菌）中NtrYX编码系统的基因邻域结构，研究发现，在β-变形菌中，rsmB和plrP同源基因位于plrSR同源基因的上游；而在α-变形菌中，ntrBC等基因位于plrSR同源基因的上游。利用fast.genomics数据库进一步分析发现，plrS同源基因与plrP同源基因在基因组中高度共定位，这强烈暗示plrP或其编码的蛋白以某种方式与plrS或PlrS相互作用，且这种相互作用对β-变形菌中TCS的功能至关重要。
RNA测序数据提示plrP和plrR上游存在内部启动子
分析RNA测序数据发现，在测试条件下，rsmB几乎不表达，而在rsmB的3′端有一个弱启动子驱动plrP和plrS的转录，在plrS的3′端有一个强启动子驱动plrR、trkA和trkH的转录。这表明该基因簇并非作为一个单一操纵子发挥作用，而是含有两个内部启动子，分别调控plrP/plrS和plrR/trkAH的表达。
PplrP和PplrR在体外具有活性
通过将推测的启动子区域克隆到无启动子的gfp基因上游并测量荧光，研究证实了PplrP（位于rsmB3′端）和PplrR（位于plrS3′端）的启动子活性。PplrP活性较弱，且在Bvg–模式下更高；而PplrR在所有测试条件下均表现出强活性。这些数据支持RNA测序的发现，表明plrP和plrR的表达由不同的启动子驱动，可能受到差异调控。
RsmB、TrkA和TrkH在小鼠感染过程中并非百日咳博德特菌持续生存所必需
通过构建rsmB、trkA和trkH的缺失突变株，并在小鼠呼吸道感染模型中比较其与野生型菌株的持续生存能力，研究发现这些突变株在鼻腔、气管和肺部的细菌载量与野生型相似。这与ΔplrS突变株在下呼吸道（LRT）严重缺陷的表型形成鲜明对比，表明rsmB和trkAH在该感染模型中并非必需。
当plrS未突变时，plrP在体外是必需的
研究尝试构建plrP的框内缺失突变株，但在野生型菌株中未能成功，表明plrP在体外是必需的。然而，在PlrSH521Q（无法磷酸化）和PlrSN525A（磷酸酶活性缺陷）突变株中，可以成功删除plrP。同样，在plrR缺失但表达磷模拟突变PlrRD52E的菌株中，也能删除plrP。这些结果表明，plrP的必需性依赖于PlrS的功能，并且PlrP可能通过防止PlrS发挥强磷酸酶活性来维持PlrR~P（磷酸化PlrR）的水平，从而保证细菌在体外的存活。
PlrP的必需性需要PlrS的PDC结构域
由于PlrP预测含有信号肽，可能被转运到周质空间，研究推测PlrP通过PlrS的PhoQ-DcuS-CitA（PDC）感知结构域影响其活性。通过构建缺失PlrS PDC结构域的菌株（ΔPDC），发现可以在该菌株中成功删除plrP，这表明PlrP的体外必需性依赖于PlrS的PDC结构域，支持了PlrP通过PDC结构域调节PlrS活性的假说。
PlrS的PDC结构域对于百日咳博德特菌在下呼吸道的持续生存并非必需，且如果PlrP在体内发挥作用，其作用需要PlrS的PDC结构域
在鼠类感染模型中，ΔPDC和ΔPDC ΔplrP突变株在呼吸道各部位的细菌载量与野生型相似，表明PlrS的PDC结构域在体内并非必需。如果PlrP在感染过程中起作用，那么该作用也需要PlrS的PDC结构域。
证据表明PlrR在体内必须处于高磷酸化水平
虽然ΔplrS和PlrSH521Q菌株在体外可以生长，但在下呼吸道（LRT）中被迅速清除，这表明PlrR~P是细菌在LRT存活所必需的。表达磷模拟突变PlrRD52E的ΔplrS菌株（ΔplrSPlrRD52E）在体外可存活，并且在体内其持久性缺陷远小于ΔplrS菌株，但仍略逊于野生型。这表明PlrRD52E的活性不如天然的PlrR~P，并且细菌在LRT的存活需要高水平的PlrR~P。
证据表明PlrP在体内影响PlrS活性
由于无法在野生型菌株中删除plrP，研究利用PlrSN525A突变株（磷酸酶活性缺陷）来探讨PlrP的作用。PlrSN525A菌株在LRT的持久性存在缺陷，但不如ΔplrS菌株严重。然而，PlrSN525AΔplrP双突变株在感染第1天和第3天时，其在LRT的细菌载量与野生型相似。最可能的解释是，PlrSN525A同时存在激酶和磷酸酶活性缺陷，而PlrP的缺失增强了PlrSN525A的激酶活性。这进一步支持了PlrR~P在LRT所需的水平高于体外生长时的假说，并提供了PlrP在体内影响PlrS活性的证据。
讨论
综合数据强烈表明，PlrP是PlrSR（NtrYX）亚家族TCS的第三组分。根据提出的模型（如图7所示），当百日咳博德特菌在标准实验室条件下体外生长时，PlrS作为弱激酶发挥作用（或激酶与磷酸酶活性平衡），使得PlrR~P水平较低。PlrP可能通过与PlrS的PDC结构域相互作用，阻止PlrS对PlrR~P发挥强磷酸酶活性。数据表明，PlrR~P在体外是必需的，并且在缺乏PlrS激酶活性时，PlrR可以从其他分子获得磷酸基团。在感染期间的LRT中，需要高水平的PlrR~P，这依赖于PlrS的激酶活性。PlrP也可能在体内影响PlrS活性，但其具体作用尚不清楚。
plrP并非百日咳博德特菌独有。其同源基因广泛存在于许多β-和γ-变形菌的基因组中，并且几乎总是位于plrSR同源基因的上游。这种保守的基因簇结构表明这些基因之间存在保守的功能联系。因此，其他PlrP同源物很可能也以类似方式调节其同源PlrS的激酶和/或磷酸酶活性。
本研究通过解析plrSR基因簇，不仅揭示了PlrP作为TCS第三组分的关键作用，还发现了该基因簇内存在两个独立的启动子（PplrP和PplrR），实现了plrS和plrR的差异表达调控。这为了解细菌如何感知并响应环境变化，特别是病原菌在宿主内的生存机制提供了新的见解，也为针对NtrYX家族TCS的干预策略奠定了基础。
