《Journal of Clinical Microbiology》：Analytical and clinical performance of in-house and commercial real-time PCR assays for diagnosing L. infantum visceral leishmaniasis: a study from a hub center in Northern Italy
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本综述聚焦于内脏利什曼病（VL）的分子诊断，系统比较了三种靶向不同基因（rDNA与kDNA）的实时聚合酶链反应（PCR）检测方法的分析与临床性能。研究发现，靶向动质体小环保守区（kDNA）的自制PCR检测展现出最高的灵敏度，尤其适用于外周血中寄生虫DNA浓度较低的患者检测，为提升这一致命性疾病的诊断准确性提供了关键依据。
引言
内脏利什曼病（VL）是一种由利什曼原虫属（Leishmania）寄生虫，主要为由婴儿利什曼原虫（L. infantum）引起的全身性感染疾病。该病通过白蛉叮咬传播，在南欧是地方性疾病。其临床症状如不规则长期发热、体重减轻、脾肿大等缺乏特异性，因此早期准确诊断对于患者生存至关重要。目前，缺乏普遍接受的金标准诊断方法，传统的寄生虫镜检或培养需要侵入性采样且灵敏度有限。基于聚合酶链反应（PCR）的分子方法，特别是实时PCR，因其高灵敏度和特异性，已成为VL诊断，尤其是在高收入国家的重要工具。然而，对于用于扩增的最佳遗传靶点以及自制与商用检测方法的性能比较，仍缺乏标准化方案和共识。本研究旨在评估意大利北部博洛尼亚大学医院区域参考实验室用于VL诊断的三种实时PCR检测的性能。
材料与方法
本研究是一项诊断准确性研究。比较的三种方法包括：1) 一种商用检测方法（Clonit PCR），靶向利什曼原虫18S核糖体RNA基因（rDNA）的小亚基；2) 和 3) 两种自制检测方法，分别靶向rDNA和动质体小环DNA（kDNA）的保守区。研究分为两部分：首先使用婴儿利什曼原虫参考菌株制备的标准DNA样本评估三种PCR的分析性能；其次，使用2022年8月至2024年7月期间采集的90例疑似VL患者的外周血样本，评估其临床性能。
患者的诊断基于世界卫生组织推荐的算法，结合血清学检测和PCR结果进行综合判断。血清学筛查采用基于rK39的免疫层析试纸条（ICT）和免疫酶联测定（ELISA，后改为化学发光免疫测定CLIA）。所有PCR检测均采用从全血中提取的DNA进行。
分析性能评估包括通过标准曲线确定检测限（LOD95）、扩增效率、线性范围、精确度和特异性。临床性能通过计算灵敏度、特异性及其95%置信区间（CI）进行评估，并使用Cohen‘s Kappa（κ）系数评估方法间的一致性。此外，由于缺乏完美的金标准，研究还采用了Hui-Walter框架的潜在类别模型来同时估计三种检测的敏感性和特异性。
结果
分析与检测限
分析性能评估显示，自制kDNA PCR具有最高的分析灵敏度，其扩增效率为100.21%，检测限（LOD95）最低，为1.01 × 10-1寄生虫当量/mL。相比之下，自制rDNA PCR和Clonit rDNA PCR的LOD95分别为2.29和4.11寄生虫当量/mL。自制kDNA PCR和Clonit PCR的标准曲线均表现出优异的线性（R2> 0.99）。所有检测在所有稀释度下均显示出低变异系数（CV% < 7%），表明分析间变异低。计算机分析证实，自制PCR的引物特异性靶向婴儿利什曼原虫基因组，不与锥虫（Trypanosomaspp.）或人类基因组交叉反应。使用克氏锥虫（T. cruzi）DNA进行的实验也证实了三种PCR的特异性。
临床性能
在90例临床样本中，33例（36.7%）确诊为VL。Clonit rDNA PCR的临床灵敏度为93.94%（95% CI 79.77–99.26），特异性为100%（95% CI 93.73–100.00），出现两例假阴性。自制rDNA PCR的灵敏度为96.97%（95% CI 84.24–99.92），特异性为100%。自制kDNA PCR的灵敏度达到100%（95% CI 89.42–100.00），但特异性为96.49%（95% CI 87.89–99.57），出现了两例假阳性。这两例假阳性样本中的寄生虫DNA浓度极低（分别为4.87 × 10-3和8.13 × 10-3寄生虫当量/mL）。
方法间的一致性
三种分子检测在VL识别上表现出极佳的一致性。Clonit PCR与自制kDNA PCR的Cohen’s Kappa（κ）为0.90；Clonit PCR与自制rDNA PCR的κ为0.98；两种自制PCR（rDNA vs kDNA）的κ为0.93。这均属于“优秀”的一致性范围。
定量结果的一致性
对31例三种检测均为阳性的VL样本的循环阈值（Ct）进行配对比较，发现靶向rDNA的检测（Clonit和自制）与靶向kDNA的检测之间存在显著差异（P < 0.0001）。kDNA PCR检测的Ct值更低，表明其灵敏度更高。此外，将所有kDNA PCR阳性的样本（包括33例VL阳性和2例VL阴性）根据Clonit PCR结果分组，发现Clonit PCR阳性的组别其寄生虫DNA浓度显著高于Clonit PCR阴性的组别（P = 0.0005）。
潜在类别模型结果
潜在类别模型分析得出的敏感性特异性估计值与经典分析结果相似。尽管由于数据量有限导致95%可信区间较宽且有重叠，但模型确认了所有三种检测均具有高性能。自制kDNA PCR的敏感性中位数估计值最高（94.90%），而特异性中位数估计值相对略低（92.40%）。Clonit PCR和自制rDNA PCR的特异性估计值则更高（均约97.8%）。
讨论
本研究比较了用于VL诊断的两种自制和一种商用实时PCR检测的性能。研究结果与先前报告一致，证实靶向kDNA的PCR具有最高的分析和临床灵敏度。这主要归因于kDNA在每个寄生虫细胞中存在于上千个拷贝，而rDNA仅存在于约20-40个拷贝。高灵敏度对于检测外周血中寄生虫DNA浓度低的VL患者至关重要，因为漏诊可能导致严重后果。另一方面，商用Clonit PCR在自动化提取和加样方面表现出更好的重现性和更高的特异性，但其灵敏度略低，未能检测出两例寄生虫载量极低的VL病例。
自制kDNA PCR出现的两例假阳性结果，可能反映了其对无症状亚临床感染的检测能力，但也无法完全排除污染的可能性。研究表明，kDNA靶点在应用于其他创新分析平台（如数字PCR）时也表现出优异的检测性能。
本研究的局限性包括VL阳性临床样本数量有限，以及缺乏诊断VL的完美金标准。然而，三种检测方法表现出的优秀一致性（κ ≥ 0.9）支持了它们用于VL分子诊断的可靠性。
结论
综上所述，本研究评估的三种实时PCR检测方法在使用外周血样本诊断婴儿利什曼原虫引起的VL方面均表现出高准确性。其中，靶向kDNA的自制PCR检测展现出最高的观察灵敏度，这对于识别低寄生虫载量患者具有关键意义。然而，其在特异性方面略逊于rDNA靶向的检测。因此，强烈建议开发以kDNA为靶点的自动化诊断工具，以提高对婴儿利什曼原虫VL的识别能力，特别是在低流行区或免疫抑制患者中。这一发现为推动更准确、更灵敏的VL分子诊断标准的确立提供了重要证据。
