两种商用PCR试剂盒检测肺炎支原体大环内酯类药物耐药性的临床性能评估

《Journal of Clinical Microbiology》：Clinical performance of two commercial PCR assays for the detection of macrolide resistance in Mycoplasma pneumoniae

这篇文献评估了LightMix Modular Mycoplasma Macrolide (TIB Molbiol)和Mycoplasma pneumoniae and Macrolides-Resistant Strain Nucleic Acid Test (Mole Bioscience)两种商用试剂盒检测肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae, M. pneumoniae)大环内酯类药物耐药性的临床性能。研究以23S rRNA测序为金标准，发现TIB Molbiol试剂盒的总体灵敏度和特异性分别为90.9%和97.9%，而Mole Bioscience试剂盒则存在较高漏检率(27.7%阳性样本未检出M. pneumoniae)，且两款试剂盒均无法可靠检测2067位点的耐药相关突变。随着肺炎支原体在全球的再次流行，开发能够检测所有耐药突变的新型检测方法至关重要。

材料与方法

研究人员对8株肺炎支原体菌株、10株非肺炎支原体的支原体菌株以及237份临床样本进行了测试。菌株包括野生型和携带不同23S rRNA基因突变的临床分离株。临床样本包含耳鼻喉(ENT)拭子、鼻咽分泌物、呼吸道样本和支气管肺泡灌洗液。所有样本均使用MagNA Pure 96系统提取核酸。检测方法以23S rRNA Sanger测序作为参考标准，对两种商用试剂盒进行比较评估。

TIB Molbiol的LightMix Modular Mycoplasma Macrolide试剂盒采用荧光共振能量转移(FRET)技术，通过熔解曲线分析来检测肺炎支原体和生殖支原体(Mycoplasma genitalium)的23S rRNA基因突变，但厂家未明确披露其检测的具体突变位点。Mole Bioscience的试剂盒则采用TaqMan技术，同时靶向肺炎支原体P1粘附素基因进行病原检测，并特异性地检测A2063G和A2064G两个耐药相关突变。

结果

在菌株和参考株的评估中，TIB Molbiol试剂盒能检测到所有对应的肺炎支原体和生殖支原体菌株，但对一株无突变的嗜两性支原体(Mycoplasma amphoriforme)临床分离株产生了假阳性耐药结果。使用Mole Bioscience试剂盒时，所有八株肺炎支原体菌株均被正确检出，但在高DNA浓度下，四个不含2063-2067区域突变的野生型菌株被错误地归类为耐药；将DNA稀释度从1/100提高到1/10,000后，这些菌株得以被正确分类为敏感。

在237份临床样本中，Mole Bioscience试剂盒未能检出27.7%的肺炎支原体阳性样本（主要是低载量样本），而TIB Molbiol试剂盒的漏检率仅为5.1%。针对大环内酯耐药相关突变检测的临床灵敏度，TIB Molbiol试剂盒为90.9%，Mole Bioscience试剂盒为81.5%。所有被误判为野生型的结果都对应着在23S rRNA基因2067位点（肺炎支原体编号）存在突变的样本。两种试剂盒的临床特异性分别为97.9% (TIB Molbiol)和94.4% (Mole Bioscience)。

值得注意的是，在TIB Molbiol试剂盒的检测中，4份肺炎支原体阴性样本产生了熔解曲线信号，其中两份被鉴定出含有嗜两性支原体或偶发支原体(Mycoplasma faucium)。此外，TIB Molbiol试剂盒也能检测到生殖支原体和嗜两性支原体中的23S rRNA突变，而Mole Bioscience试剂盒则在高载量样本中产生了假阳性耐药结果。

分层分析显示，对于呼吸道样本（痰液、气管分泌物和支气管分泌物），Mole Bioscience试剂盒的整体性能较差，其总体一致率和卡帕值分别仅为73.7%和0.48，尽管其说明书已标明可用于痰液样本。

讨论

本研究评估了两种用于检测肺炎支原体大环内酯耐药相关突变的商用试剂盒。这两种试剂盒设计目的不同：Mole Bioscience试剂盒旨在作为同时检测病原体和耐药性的一线检测方法；而TIB Molbiol试剂盒则设计为仅用于检测耐药性的二线检测方法。

研究发现，Mole Bioscience试剂盒对肺炎支原体检测的灵敏度有限，这严重影响了其耐药性检测的准确性。其设定的循环阈值(C_T)截断值（35.01）可能过于严格，导致大量低载量样本被判定为阴性。研究提示，若将C_T阈值提高到38.01，可显著改善检出率。此外，该试剂盒在高载量菌株和临床样本中存在饱和现象或交叉反应，导致假阳性耐药结果，这可能误导临床使用毒性更大的二线抗生素。

TIB Molbiol试剂盒虽作为二线检测表现更优，但其设计初衷也用于检测生殖支原体。考虑到生殖支原体在口咽部的潜在定植（研究报道约为0.5%-1%）及其全球范围内的高耐药率（2018-2021年间为33.3%），该试剂盒可能会高估肺炎支原体的耐药性。同时，它对嗜两性支原体DNA的扩增也影响了其特异性。

一个关键发现是，两款试剂盒均无法可靠检测2067位点的耐药相关突变（如A2067C和A2067G）。在本研究涉及的37份突变样本中，此类突变占16.2%，具有临床相关性。剔除这些样本后，两款试剂盒检测其他突变的灵敏度均达到100%。

结论

Mole Bioscience试剂盒对肺炎支原体的检测灵敏度有限，从而影响了其耐药性识别的准确性。TIB Molbiol试剂盒则对肺炎支原体缺乏特异性，可能因扩增其他支原体物种的DNA而错误地将耐药突变归因于肺炎支原体。更重要的是，两款试剂盒均不能可靠地检测2067位点的耐药相关突变。鉴于肺炎支原体在全球的再次流行以及某些地区居高不下的大环内酯耐药率，未来亟需开发新型、高特异性且能够覆盖所有耐药相关突变的检测方法。