病毒谱系与暴露模式共同调控甲型流感病毒在豚鼠体内的宿主内空间动力学

《Journal of Virology》：Viral lineage and mode of exposure modulate within-host spatial dynamics of influenza A viruses in a guinea pig model

本文通过豚鼠模型，揭示了不同谱系甲型流感病毒（IAV）在上下呼吸道（URT/LRT）的复制差异及其空间分布规律。研究发现，大流行H1N1病毒（pH1N1）能在整个呼吸道复制，而季节性H3N2病毒则主要局限于上呼吸道。利用遗传条形码（barcode）技术追踪病毒群动态，发现病毒在向下呼吸道（肺）扩散时会经历显著的种群瓶颈，导致遗传多样性降低。研究表明，呼吸道不同区域（URT/LRT）的独特环境强烈塑造了病毒的宿主内传播与演化路径。

　　

引言

甲型流感病毒（IAV）能够在哺乳动物宿主的上下呼吸道（URT和LRT）感染多种细胞类型。上呼吸道包括鼻腔、口腔、咽和喉的组织，下呼吸道则由气管和肺组成。呼吸道的这些区域在细胞类型、频率和空间排列上存在显著差异，并具有不同的粘液水平、纤毛运动、免疫反应性、温度以及IAV所利用的唾液酸受体类型和可用性。这些特征共同塑造了IAV对上下呼吸道组织的嗜性以及病毒在每个区域内扩散的特性。理解IAV在上下呼吸道感染的动力学至关重要：临床上，下呼吸道感染尤为严重，是发病和死亡的主要原因；而上呼吸道感染对于传播以及病毒在宿主群体水平的演化则至关重要。

结果

1. 鼻内接种物在呼吸道的去向

鼻内递送是动物接种呼吸道病毒的常用方法。为了评估液体接种物的去向如何随体积变化，研究人员向豚鼠鼻内给予30、100或300 μL的蓝色组织标记染料，然后收获呼吸道组织进行大体检查。结果显示，所有测试体积下鼻腔均被染色。然而，仅在最高体积（300 μL）时，才观察到口腔和下呼吸道（包括气管和肺）的染色。值得注意的是，所有三只接受300 μL染料的豚鼠的食管也被染色，表明部分接种物被吞咽。这项观察为后续实验采用300 μL接种体积以确保接种物到达肺部提供了依据。

2. pH1N1在豚鼠下呼吸道复制，而季节性H3N2则不能

为了探究流感病毒在豚鼠模型下呼吸道复制的程度，研究人员使用300 μL接种物鼻内接种豚鼠，病毒为季节性毒株A/Texas/50/2012 (H3N2)或大流行毒株A/California/07/2009 (H1N1)。结果发现，H3N2和pH1N1病毒在鼻腔灌洗液中均呈现高滴度。然而，仅在接种pH1N1的动物肺组织中检测到感染性病毒。尽管在感染后1至3天上呼吸道组织中的病毒滴度相当，但下呼吸道病毒阳性率在感染后第1天最高，这表明下呼吸道病毒清除速度快于上呼吸道。针对流感A病毒核蛋白的免疫组织化学染色结果证实了季节性H3N2和pH1N1在下呼吸道复制的差异：虽然两种病毒感染的豚鼠鼻腔上皮中病毒抗原都很丰富，但仅在接种pH1N1动物的主要气道肺上皮中观察到病毒抗原。在鼻腔中，pH1N1或H3N2接种动物之间抗原阳性细胞的谱系相似，包括呼吸上皮细胞、嗅觉上皮细胞、嗅觉神经元、杯状细胞和白细胞。在肺部，pH1N1抗原阳性可见于细支气管粘膜上皮、肺泡细胞和白细胞。4 PFU. (A) Viral titers in nasal washes. Dashed lines indicate the limit of detection (50 PFU). (B) Schematic of the respiratory tissues sampled. NS: nasal swab, NT: nasal turbinates, SP: soft palate, OS: oral swab, UT: upper trachea, LT: lower trachea, 1–16: lung lobes. (C) Heat map showing viral titers according to the tissue locations labeled in (B). SP, 15, and 16 are not shown because these samples were not collected in this experiment. Dark purple indicates results below the limit of detection. Gray coloring indicates that samples were not collected. DPI = day post-inoculation. (D) Immunohistochemical staining for influenza A virus nucleoprotein at day 3 post-inoculation. Positive staining is visible as dark brown coloring. Arrows indicate antigen-positive cells within intact epithelia. Asterisks mark positive catarrhal exudate. Unique numbers are used to identify each animal and are applied consistently in all figures.">

3. 气溶胶暴露和传播后同样观察到pH1N1的下呼吸道复制

为了将IAV在豚鼠体内嗜性的特征扩展到更多暴露情境，研究人员检测了通过气溶胶途径感染或与感染动物共同饲养（传播）后pH1N1复制的空间分布。对于气溶胶暴露，将5 × 10⁴PFU（高剂量）或5 × 10²PFU（低剂量）的病毒气溶胶化为约1-5 μm直径的颗粒。高剂量接种导致豚鼠产生感染性感染，在整个研究期间可在鼻腔灌洗液和呼吸道组织中检测到。相比之下，低剂量接种在鼻腔灌洗液中未检测到病毒，但在每只豚鼠的2-3个肺组织切片中检测到低水平病毒。在高剂量组，鼻腔中病毒抗原丰富，而肺中稀疏。对于传播实验，将接受者豚鼠与在24小时前鼻内接种pH1N1病毒的供体共同饲养。在接受者动物的鼻腔灌洗液中，病毒滴度在供体接种后第5-6天达到峰值。在接受者动物的组织中，上呼吸道组织切片（尤其是鼻甲）病毒载量高，而肺切片中的病毒阳性率相对于鼻内接种或气溶胶暴露后所见则稀疏且强度低。流感A病毒抗原的免疫组织化学染色显示了相似趋势，鼻腔中的抗原阳性率远高于肺和气管。2 PFU for the high dose and (1.75 ± 0.57) × 10⁰PFU for the low dose. (A) Viral titers in nasal washes. Dashed lines indicate the limit of detection (50 PFU). (B) Heat map showing viral titers according to the tissue locations labeled in the schematic. DPI = day post-inoculation. NS: nasal swab, NT: nasal turbinates, SP: soft palate, OS: oral swab, UT: upper trachea, LT: lower trachea, 1–16: lung lobes. Dark purple indicates results below the limit of detection. (C) Immunohistochemical staining for influenza A virus nucleoprotein at day 2 post-inoculation. Black arrows indicate antigen-positive cells with dark brown color. Unique numbers are used to identify each animal and are applied consistently in all figures.">

4 PFU or 1 × 10⁴PFU. Recipient animals were exposed to donors in the same cage, starting at 24 h post-inoculation. Donor animals have odd numbers, and recipient animals have even numbers, with donor-recipient pairs sharing the same row. (A) Viral titers in nasal washes. Dashed lines indicate the limit of detection (50 PFU). (B) Heat map showing viral titers according to the tissue locations labeled in Fig. 1B. DPI = day post-inoculation. NS: nasal swab, NT: nasal turbinates, OS: oral swab, SP: soft palate, UT: upper trachea, LT: lower trachea, 1–16: lung lobes. Dark purple indicates results below the limit of detection. Tissues were collected from recipient animals at day 4 or 5 post-inoculation of the donors, as indicated at the left. Heat maps for donor-recipient pairs that did not result in transmission are not shown. (C) Immunohistochemical staining for influenza A virus nucleoprotein at day 4 post-exposure. Black arrows indicate antigen-positive cells with dark brown color. Unique numbers are used to identify each animal and are applied consistently in all figures.">

4. 病毒多样性在上呼吸道得以维持，在向下呼吸道扩散时减少

为了更高分辨率地了解病毒群体动态，研究人员使用了一个预先建立的病毒条形码系统。该系统包含大约4000个遗传谱系，它们在NA基因片段的一个100核苷酸区域（条形码区）内存在1-12个同义突变差异。对该区域的深度测序可以高分辨率地绘制病毒谱系在宿主体内扩散的图谱。对鼻内接种pH1N1病毒的豚鼠鼻腔灌洗液中病毒条形码的测序显示，高多样性在整个感染过程中得以维持。对拭子和组织切片中病毒条形码的检查表明，病毒多样性同样在鼻拭子、鼻甲、口腔拭子和气管组织中得以维持。相比之下，从肺组织中采样的病毒群体则显示出广泛的条形码多样性范围：在一些位置，多样性与上呼吸道相似；而在几个位置，单一条形码占群体的90%以上。在下呼吸道观察到的多样性模式显示出一些解剖学规律：在每个肺叶内，靠近主要气道的切片其多样性显著高于远离主要气道的切片。虽然左右肺叶之间的病毒多样性没有差异，但肺尾侧（下部）区域的肺叶多样性显著高于肺尖侧（上部）区域。值得注意的是，尾叶的支气管与气管是连续的，而尖叶的支气管则从一到两个分支点延伸出来。A) and tissues (B) from guinea pigs intranasally inoculated with 5 × 10⁴PFU of pH1N1 virus. The composition of the inoculum is shown on the far left of panel A. In (A), each barcode is represented by a colored box, the height of which indicates barcode frequency on a linear scale. The total height of the bar is scaled to the viral titer in log₁₀PFU/mL. In the pie charts shown in (B), each barcode is represented by a colored wedge, the size of which indicates barcode frequency. Pie charts are arrayed onto a schematic diagram of the respiratory tract according to the location of sampling. White pies indicate that the tissue sample was not processed for sequencing due to a viral titer below the limit of detection (50 PFU). Gray pies indicate that sequencing data did not pass quality thresholds. Guinea pig no. 14 is not shown because all samples were below the limit of detection in plaque assay (50 PFU). Regions of the lung are labeled on the schematic at the far right to highlight differences in the extent of airway branching. In (C–F), Shannon diversity is compared between different regions in the respiratory tract. *P< 0.05, ns: P> 0.05 between indicated groups using Mann-Whitney-U(panel C and E) or Kruskal-Wallis test with Bonferroni correction (panel F), and between paired distal and proximal lobes within a single lung lobe using the Wilcoxon sign-rank test (panel D). The box represents the quartiles, while the whiskers represent the upper and lower limits of the values. Unique numbers are used to identify each animal and are applied consistently in all figures.">

通过气溶胶和基于传播方式感染的动物，其鼻腔灌洗液和组织样本总体条形码多样性较低。在上呼吸道和下呼吸道之间、肺叶位置之间或肺叶内近端与远端切片之间，未观察到多样性的显著差异。然而，条形码组成在空间和时间上的一些模式值得注意。在气溶胶接种的动物中，尽管上呼吸道多样性较低，但随时间推移保持稳定。在感染后第2天，上呼吸道和下呼吸道之间存在明显的空间异质性，这可能与接种时发生的多个独立定植事件有关。到感染后第4天，尽管上呼吸道持续复制，下呼吸道组织大部分呈病毒阴性。在传播实验中，鼻内接种的供体豚鼠在上呼吸道显示出相对较高的条形码多样性。相比之下，无论样本类型和时间点如何，接受者动物的条形码谱系均以1-3个条形码为主，这表明存在严格的传播瓶颈效应。值得注意的是，在两个上、下呼吸道均检测到病毒阳性的接受者动物中，这些位置的条形码组成相似，表明它们是单一传播事件后通过宿主内扩散形成的。

讨论

流感病毒感染下呼吸道是发病和死亡的主要原因。然而，由于获取相关样本所需的侵入性程序，人们对这类感染的特征了解不足。为了进一步了解流感病毒在整个呼吸道的嗜性和动力学，研究人员采用了豚鼠模型。研究发现，pH1N1表现出更广泛的嗜性，可延伸至下呼吸道，而季节性H3N2病毒则主要局限于上呼吸道。然后利用条形码系统检查病毒群体动态，揭示了与上呼吸道的距离和气道分支会施加遗传瓶颈，使得在上呼吸道和下呼吸道不同部位复制的pH1N1群体可能高度不同。病毒剂量、暴露方式和接种体积都被证明可以调节流感病毒感染的进程。由于直接递送至肺部，使用较大体积进行气管内和鼻内滴注通常会产生更严重的疾病。到达肺部所需的体积取决于宿主物种。在豚鼠中，通常使用300 μL的鼻内接种物体积来模拟流感病毒感染，本研究证实这个体积可以到达肺部，而30或100 μL的体积则停留在鼻腔。值得注意的是，部分接种物会沉积在口腔和消化道，尽管其对流感病毒感染进程的影响尚不清楚。与传播或气溶胶接种相比，鼻内接种后肺部的病毒检测更为稳健，尽管鼻腔灌洗液中的滴度相当。这可能表明在传播过程中下呼吸道的定植是有限的。尽管本研究仅测试了源自人H3N2和pH1N1谱系的各一种病毒，但结合文献数据来看，观察到的嗜性很可能代表了相关毒株的特征。IAV的嗜性受其优先结合的唾液酸受体（在不同呼吸道区域的流行程度不同）和病毒复制的温度敏感性的调节。像本研究中使用的A/CA/07/2009毒株这样的2009年大流行毒株，与季节性IAV一样，结合α-2,6连接的唾液酸受体，但在此类唾液酸化聚糖类别内的特异性存在差异，这些差异可能促成了pH1N1病毒更广泛的嗜性。此外，许多季节性IAV在模拟人上呼吸道温度的33°C下表现出更稳健的复制，而早期的pH1N1病毒在33°C和37°C下显示出相当的复制潜力。在37°C下的稳健复制对于病毒向下呼吸道传播可能很重要。通过监测病毒条形码在时间和整个呼吸道多个位置的变化，可以深入了解病毒群体在扩散、扩张、收缩和传播给接触者过程中的遗传结构。与之前在雪貂中使用类似方法的研究一致，本研究观察到鼻内接种后条形码多样性在上呼吸道和气管中得以维持，但在向肺部扩散时丢失。此外，还可以检测到多样性随着支气管分支增加而降低的模式：尖叶的多样性低于尾叶。尾叶的支气管与气管连续，而尖叶的支气管则从一到两个分支点延伸出来。同样，在一个肺叶内，多样性随着与主要气道距离的增加而降低。这些模式表明，宿主内瓶颈的出现是由于病毒颗粒在通过气道转运过程中的物理损失造成的，可能发生在接种时或继发性扩散过程中。多样性的进一步限制可能源于沉积部位活跃的宿主抗病毒反应和/或单细胞水平病毒爆发大小的异质性。本研究中观察到的气溶胶接种pH1N1后上呼吸道条形码多样性较低，与在雪貂中使用类似方法观察到的结果形成对比。虽然这种差异可能与宿主物种或用于雾化病毒的不同仪器有关，但最可能的促成因素是病毒剂量。传播后也观察到较低的条形码多样性，这与之前在雪貂、豚鼠和自然感染人类中描述的严格瓶颈一致。最近有报告指出，这种严格瓶颈源于多样性在两个阶段的损失：宿主间转移和宿主内建立。这种两阶段过程在本研究数据中不明显，即使是接受者动物最早期的样本也显示出极低的多样性。这种差异归因于传递给接受者动物的更具多样性的病毒群体的瞬时性，以及不同IAV毒株病毒建立和扩增动力学的差异。总而言之，本研究数据扩展了先前关于H3N2和pH1N1病毒在豚鼠体内不同嗜性的观察。通过检查伴随pH1N1在整个呼吸道传播的群体遗传变化，数据进一步表明，通过气道长距离扩散是施加随机多样性损失的机制。由此产生的宿主内病毒群体的空间异质性，为一个宿主体内遵循多种不同进化路径创造了潜力。

材料与方法

本研究使用了两种病毒株：甲型流感病毒A/California/07/2009 (H1N1)（全文称为pH1N1）和甲型流感病毒A/Texas/50/2012 (H3N2)（全文称为H3N2）。对于pH1N1，神经氨酸酶基因被修饰为在12个位点双等位，并利用包含双等位位点的修饰DNA文库，通过八质粒病毒拯救系统生成带有遗传条形码的病毒库。所有动物实验均使用体重300-350g的Hartley豚鼠。通过鼻内滴注蓝色组织标记染料来确定液体递送目的地。对于鼻内接种，每只豚鼠通过鼻内滴注接受300 μL含5×10⁴PFU条形码pH1N1或H3N2病毒的接种物。对于传播实验，每只供体豚鼠类似地鼻内接种300 μL含5×10⁴或1×10⁴PFU的病毒。24小时后，将接受者豚鼠与供体豚鼠共同饲养。对于气溶胶暴露，豚鼠暴露于由600 μL体积雾化产生的气溶胶，该体积每只豚鼠含有5×10⁶（高）或5×10⁴（低）PFU病毒。沉积在每只豚鼠呼吸道中的病毒量估计为(1.75 ± 0.57) × 10²PFU（高）或(1.75 ± 0.57) PFU（低）。为了避免鼻灌洗期间病毒群体的人为扩散，在一组豚鼠中进行鼻腔灌洗，而在另一组不同的豚鼠中进行组织采集。所有组织切片均置于预装有1.7mm氧化锆珠和1 mL PBS的组织匀浆管中，通过珠磨进行匀浆。对于肺部切片，使用6mm活检打孔器取样。气管分为上下两半，然后切成2-4个环以便匀浆。使用骨剪暴露鼻腔，并用手术刀切除鼻上皮以获取鼻甲组织。鼻腔前部和口腔拭子在死后使用超细尖拭子采集。对于组织病理学和免疫组织化学，组织在10%中性福尔马林中固定至少24小时。肺部用10%中性福尔马林充气固定以保存组织结构。使用针对流感A病毒核蛋白的多克隆抗体进行免疫组织化学染色，并对染色强度进行半定量评分。对所有斑块检测阳性的pH1N1样本尝试进行条形码测序。使用特异性引物通过一步法RT-PCR扩增pH1N1的条形码区域，并使用Illumina Miseq平台进行测序。使用BarcodeID软件确定条形码频率和多样性指标，香农多样性根据公式H = ?∑ p_i· ln(p_i)计算。统计分析使用SciPy和JupyterLab中的Mann-Whitney U检验、Kruskal-Wallis检验和Wilcoxon符号秩检验模块进行。