硝化作用是氮（N）循环的重要组成部分，它调节着植物和土壤微生物对氮的利用，从而影响陆地生态系统的生产力（Alves等人，2013；Thion等人，2016）。硝化作用可以仅由完全的氨氧化菌（Comammox，CMX）完成（Daims等人，2015）。或者，它可以分两个阶段进行：首先由氨氧化细菌（AOB）和/或古菌（AOA）进行氨氧化（K?nneke等人，2005），然后由亚硝酸盐氧化细菌（NOB）将生成的亚硝酸盐氧化为硝酸盐（Canfield等人，2010）。大多数关于硝化作用的研究都集中在氨氧化微生物（AOM）对氨氧化的贡献变化（Hink等人，2018；Duan等人，2018）以及硝化菌的分布（Pester等人，2014；Han等人，2018）上，而对亚硝酸盐氧化或氨氧化和亚硝酸盐氧化步骤之间的耦合关注较少（Wang等人，2015；Han等人，2018）。
理解硝化菌多样性与两步硝化作用之间的关系对于阐明硝化机制至关重要。然而，关于硝化菌在硝化过程中的基因丰度和丰富度的研究结果并不一致。例如，一些研究发现氮添加抑制了AOA但促进了AOB，而其他研究则发现了相反的模式或没有显著影响，这取决于生态系统类型、氮的形式和施用率（Carey等人，2016；Ouyang等人，2018）。然而，当环境条件发生变化时，硝化菌群落的功能基因丰度和丰富度很少简单地减少和/或增加。相反，由于物种灭绝和定殖，硝化菌群落的组成通常会发生变化（Blowes等人，2019；Ladouceur等人，2022）。硝化菌群落组成对硝化过程的影响仍然知之甚少。
群落组成的差异包括两个方面：与物种身份相关的物种替代和与物种损失和增加相关的丰富度差异（Carvalho等人，2012；Marini等人，2013）。分析替代和丰富度差异有助于我们深入理解物种身份效应和物种丰富度效应对群落组成的影响（Podani和Schmera，2011）。Yang等人（2021）发现农田中的硝化速率主要由AOA群落中的大多数微生物驱动，较高的丰富度导致硝化速率增加。相比之下，森林土壤表现出身份效应，其中通过网络分析确定的关鍵AOB物种决定了硝化速率。此外，最近的研究表明，关键NOB物种Nitrospira通过促进硝化菌之间的协同代谢相互作用来驱动硝化过程（Yang等人，2024）。硝化菌群落组成的变化以及随之而来的物种身份和物种丰富度的变化可能会分别不同地影响氨氧化和亚硝酸盐氧化过程。
为了全面理解硝化菌群落与硝化作用之间的关系，评估硝化菌与关键分类群之间的复杂相互作用非常重要。两步硝化过程耦合的关键在于AOM和NOB的有效合作（Muller等人，2025）。在添加了氮的土壤中，AOB和NOB之间的相互作用比简单的互利关系更为复杂。一些NOB通过水解尿素为AOB提供氨，形成一种“交叉喂养”过程（Koch等人，2015；Daims等人，2016）。分子生态网络分析为解决这种相互作用的复杂性提供了新的范式。具有正向和负向链接的交互网络（Montoya等人，2006；Toju等人，2017）允许识别关键连接者并评估它们的生态系统影响（Romdhane等人，2022）。尽管已经进行了研究来探讨氮添加如何影响硝化作用，但对于AOM–NOB共现网络与硝化作用的关系，尤其是在高山生态系统中的关系，了解仍然有限。
土壤生物多样性和硝化作用的主要驱动因素包括氮沉积和植被变化（Chapman等人，2006；Bardon等人，2018）。其中第一个驱动因素在青藏高原尤为重要，该地区面临着严重的氮沉积现象（Liu等人，2013）。大量文献记录了氮富集后微生物多样性的减少（Wang等人，2018；Wei等人，2020b）。因此，预计氮添加将改变硝化菌的多样性和组成，从而刺激硝化速率。氮沉积可以增强氨氧化（Barnard等人，2005；Lu等人，2011）并使硝化菌群落从寡营养型（AOA/Nitrospira-类似NOB）转变为富营养型分类群（AOB/Nitrobacter-类似NOB）（Nowka等人，2015；Frey等人，2023）。
关于第二个驱动因素，青藏高原的一个普遍变化是本地植物Ligularia virgaurea的扩张（Wang等人，2008），这通常伴随着土壤资源空间格局的巨大变化（Ade等人，2021；Wang等人，2024），这可能强烈影响硝化菌群落和硝化速率（Ma等人，2019）。L. virgaurea的扩张可以释放有机化合物并改变铵和硝酸盐的可用性，加剧硝化菌和异养微生物之间的竞争，从而抑制硝化作用（Subbarao等人，2015；Nardi等人，2020）。
许多研究集中在单一因素（植物扩张或氮沉积）如何影响硝化作用上。然而，多个驱动因素相互作用，氮添加和植物扩张可能通过叠加、协同或拮抗效应共同影响硝化菌群落和硝化过程（Broadbent等人，2024）。阐明氮添加和植物扩张后硝化菌群落和两步硝化过程的变化是尝试预测和缓解气候变化因素对氮循环动态影响的关键。
在这里，我们进行了一项野外实验，以研究氮添加和L. virgaurea扩张对两步硝化过程的影响。我们测量了潜在的氨氧化（PAO）和潜在的亚硝酸盐氧化（PNO）速率，并评估了三组硝化菌（AOA、AOB和NOB）在基因丰度、多样性、群落组成和共现网络属性方面的响应。我们测试以下假设：（1）氮添加促进两步硝化过程，而L. virgaurea扩张抑制这一过程；（2）AOA、AOB和NOB在基因丰度、多样性和物种相互作用响应方面对氮添加和L. virgaurea扩张有显著差异；（3）与多样性和基因丰度相比，硝化菌的群落组成主要驱动硝化速率的变化，这是由于物种灭绝和定殖的同时发生。
