草鱼（Ctenopharyngodon idellus）细菌性败血症期间钙信号通路的失调

细菌性败血症在草鱼中导致腹部红肿、肠道炎症等症状，生化指标下降但CRP和PCT升高。转录组分析发现钙信号相关基因表达异常，荧光显微镜显示感染后细胞膜电位改变和钙离子浓度升高，Western blot证实CaN/NFAT通路激活。

　　

Jinhua An|Mengyu Yuan|Xiaocong Kong|Peipei Yi|Xiandong Xu|Chungen Wen|Qingxiang Zeng|Baoqing Hu

江西省水产种质创新与利用重点实验室，南昌大学渔业科学系，中国南昌330031

摘要

细菌性败血症在草鱼养殖中是一个重大挑战，导致了显著的经济损失。Ca²⁺作为第二信使，调节着多种细胞生物过程，包括细胞存活、凋亡和免疫反应。在这项研究中，我们建立了一个草鱼细菌性败血症模型。患病鱼表现出典型的败血症症状，如腹部发红、肛门红肿、肠道炎症和出血。患病鱼的常规生化指标显著下降，但败血症标志物C-反应蛋白（CRP）和前钙素原（PCT）显著升高。用Aeromonas hydrophila和Aeromonas veronii刺激后进行的转录组分析显示，分别有241个和230个与钙信号传导相关的基因表达差异，表明草鱼在细菌性败血症期间钙信号传导出现紊乱。这些发现表明草鱼在细菌性败血症期间钙信号传导受到干扰。使用荧光计和荧光显微镜的观察结果显示，细菌感染改变了CIK和CISF细胞的膜电位，这可能与细胞内渗透压和Ca²⁺转运的调节有关。进一步的研究表明，细菌感染后细胞内Ca²⁺水平显著升高，同时部分Ca²⁺从内质网中释放出来。此外，Western blot分析显示NFAT在蛋白质水平上发生了去磷酸化。这一结果与通过qPCR检测到的与CaN/NFAT信号通路相关的基因表达变化一致。这些发现表明，细菌性败血症通过改变细胞膜电位、促进钙通道开放、增加细胞内Ca²⁺水平以及最终激活CaN/NFAT信号通路来影响宿主的免疫反应。

引言

细菌性败血症对草鱼（Ctenopharyngodon idellus）的养殖构成了严峻挑战，草鱼是一种高价值的淡水鱼类，以其较高的产量而闻名。这种疾病的爆发导致了严重的经济损失，并继续威胁着中国草鱼产业和淡水养殖的可持续性（Luan和Wang，2021；Wei等人，2023）。从病理学上看，细菌性败血症是一种全身性炎症反应综合征。该综合征由病原体或其病原体相关分子模式的系统性传播引发，最终导致多器官血管炎、血栓性出血灶和败血性休克。草鱼的细菌性败血症通常由Aeromonas属细菌引起（Irshath等人，2023）。这些细菌分泌多种细胞外产物，包括溶血素、气溶素、细胞毒素和肠毒素（Allan和Stevenson，1981）。这些毒力因子导致了多种鱼类疾病，包括运动性气单胞菌败血症（MAS）、红鳍病和其他形式的细菌性败血症。常见症状包括组织肿胀、水肿、红色溃疡、坏死和全身性出血（Thirumalaikumar等人，2021）。

败血症会导致细胞内钙超载并放大炎症反应（Xu等人，2024）。作为第二信使，钙离子（Ca²⁺）激活多种钙依赖性蛋白激酶（如CaMKK），从而促进炎症通路的激活，包括NF-κB和NLRP3，加剧全身性炎症反应（Racioppi等人，2012）。在败血症背景下，多种炎症介质可以激活细胞膜中的钙通道，导致细胞内游离钙浓度迅速增加，从而形成所谓的“钙超载”状态（Xu等人，2024；Zhang等人，2025）。研究表明，先天免疫系统的激活在败血症中起着关键作用。在此过程中，膜结合的Toll样受体4（TLR4）通过识别细菌脂多糖（LPS）并触发下游炎症级联反应而发挥关键作用（Cao等人，2025）。这些诱导机制的激活依赖于宿主细胞中的微生物感知和识别，这是通过模式识别受体完成的（Luan和Wang，2021）。此外，大量证据表明Ca²⁺信号传导参与多种疾病，包括癌症、自身免疫疾病和病毒感染（Gross等人，2020；Komici等人，2020；Zhou等人，2009）。由于Ca²⁺信号传导调节多种生物过程，如细胞增殖、存活、凋亡和免疫反应（Liang等人，2025），它已成为模式识别受体建立有利于控制外源性病原因子的细胞环境的理想靶点（Kong等人，2021）。

静息细胞的质膜上存在明显的Ca²⁺浓度梯度，细胞内浓度大约比细胞外浓度低20,000倍（Patergnani等人，2020）。Ca²⁺信号传导由细胞质内Ca²⁺的快速升高及其随后恢复所调控。这一过程由位于质膜和细胞内的Ca²⁺通透性通道、泵（如SERCA、PMCA）和交换器（包括NCX、NCLX）以及其肌肉特异性对应物——内质网（ER）、高尔基体、线粒体和溶酶体调节（Kong等人，2021）。在刺激下，先天免疫受体（如FcγR或TLR）识别特定配体，如免疫复合物或病原体成分。这种识别会触发蛋白酪氨酸激酶的招募和激活，导致大型信号复合物的形成，包括T细胞激活链接（LAT）和含有SH2结构域的76 kDa白细胞蛋白（SLP-76）。这些事件最终导致酪氨酸磷酸化以及磷脂酶C γ（PLC-γ）的激活（Feske，2007）。PLC-γ水解磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸（PIP₂），生成肌醇-1,4,5-三磷酸（IP₃）和二酰基甘油（DAG）——两种关键的第二信使（Oh-hora和Rao，2008）。IP₃与ER膜上的IP₃R受体结合，导致储存在ER中的Ca²⁺释放，从而增加细胞质内Ca²⁺浓度。这种初始增加还促进了质膜钙通道的开放，使细胞外Ca²⁺流入细胞（Oh-hora和Rao，2008）。升高的细胞质内Ca²⁺激活了钙调神经磷酸酶/核因子活化T细胞（CaN/NFAT）信号通路，进而通过CaN促进NFAT的去磷酸化，并进一步调节下游转录因子的表达。此外，Ca²⁺信号传导还影响Ras通路和MAPK级联反应，从而调节免疫反应（Oh-hora和Rao，2008；Prasad和Inesi，2011）。

现有证据表明，在病理或毒性压力下，钙信号传导在水生动物的免疫反应和调节过程中起作用。在Thermophilus tetradactylus中，钙信号传导通过钙调蛋白（CaM）和钙调神经磷酸酶（CaN）介导内吞作用和吞噬作用（Wu等人，2021）。在斑马鱼（Danio rerio）中，镉中毒可以受到Ca²⁺的影响，在一定程度上可以抑制Cd²⁺的生物积累（Gao等人，2024）。微藻虾青素已被证明可以通过调节线粒体Ca²⁺稳态来缓解聚苯乙烯微塑料引起的鲤鱼头肾淋巴细胞的坏死和炎症反应（Diao等人，2023）。在缺氧条件下，Micropterus salmoides的ER中会发生Ca²⁺外流，且Ca²⁺转运蛋白在质膜和线粒体膜上高度表达（Zhao等人，2023）。在这项研究中，通过腹腔注射Aeromonas hydrophila和Aeromonas veronii成功建立了草鱼的细菌性败血症模型。该模型通过病理表型、典型的败血症生化指标和组织病理学评估进行了系统验证。随后对与钙信号传导相关的基因表达进行的转录组分析显示，Ca²⁺稳态与免疫反应之间存在密切关联。进一步的细胞水平分析表明，细菌感染显著增加了细胞内游离Ca²⁺浓度，破坏了细胞膜电位，并促进了NFAT的去磷酸化和激活。功能验证证实，Ca²⁺通过CaN介导NFAT的去磷酸化，从而启动了CaN/NFAT信号轴。这一轴调节草鱼免疫细胞中的炎症因子表达，并参与了细菌性败血症的病理过程。

草鱼细菌性败血症模型的建立

草鱼来自中国江西省宜春市的一个养殖场，平均体长为20±5厘米，平均体重约为200±5克。在实验室水箱中适应一段时间后，当鱼表现出稳定的生长和生理状态时，开始进行实验。选择了120条体重和长度相似、身体状况良好的鱼，将其分为四组，每组30条鱼。

草鱼的细菌性败血症模型成功建立

人工感染A. hydrophila

的草鱼在24小时内表现出腹部明显发红、肛门红肿、肠道严重炎症和发红以及鳃部颜色变为深红色。同样，感染A. veronii

的草鱼在肛门区域出现可见的红肿，从肛门到腹鳍区域有广泛的出血，肠道和腹部也有出血迹象。

讨论

细菌性败血症仍然是全球水产养殖业面临的严重挑战（Aboyadak等人，2024）。Aeromonas属细菌被认为是细菌性败血症最重要的病原体，因为它们是在应激条件下引起鱼类疾病的 opportunistic 病原体（Stratev和Odeyemi，2017）。Das等人发现A. hydrophila是导致鱼类养殖场疾病的主要病原体，包括败血症，导致高死亡率和经济损失（Pridgeon和Klesius，

结论

总之，A. hydrophila和A. veronii可引起草鱼的细菌性败血症。感染鱼表现出典型的气单胞菌败血症症状。我们观察到感染鱼的常规血清生化指标（TP、ALT、BUN、GOT、TG）显著下降，过氧化物酶活性也失调。相比之下，败血症标志物CRP和PCT显著升高。细菌感染导致与钙信号传导相关的基因失调，表明钙信号传导可能在此过程中起作用

CRediT作者贡献声明

Jinhua An：撰写初稿、软件使用、实验研究、数据管理。Mengyu Yuan：实验研究、概念构思。Xiaocong Kong：方法学设计、实验研究。Peipei Yi：数据管理、概念构思。Xiandong Xu：实验研究、数据分析。Chungen Wen：资源提供、方法学设计。Qingxiang Zeng：数据管理、概念构思。Baoqing Hu：撰写、审稿与编辑、项目监督、资金筹集。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了江西省农业研究系统专项资金的资助（编号：JXARS-03）。