《Aquaculture》：Study of
Renibacterium salmoninarum infection in rainbow trout (
Oncorhynchus mykiss) and the effect of temperature in an
in-vivo cohabitation challenge
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在虹鳟鱼中通过共培养模型研究肾综合征副溶血菌（R. salmoninarum）的传播动力学，发现温度显著影响感染进程，6℃时细菌再分离率更高且存活率降低更滞后，环境DNA分析有效监测水体中的菌体DNA，模型揭示了低、中、高剂量感染下的三种感染情景：亚临床感染、慢性感染和临床典型肾病变。
阿莱杭德拉·维拉米尔-阿隆索（Alejandra Villamil-Alonso）、洛恩·马德森（Lone Madsen）、蒂内·M·伊伯格（Tine M. Iburg）、尼尔斯·约根·奥莱森（Niels J?rgen Olesen）、尼科洛·文德拉明（Niccolò Vendramin）、阿尔赫利亚·昆卡（Argelia Cuenca）
丹麦技术大学国家水资源研究所鱼类和贝类疾病部门，丹麦Kongens Lyngby
摘要
Renibacterium salmoninarum是细菌性肾病（BKD）的致病菌，这是一种影响全球野生和养殖鲑科鱼类的重大传染病。除了能够实现真正的垂直传播外，这种细菌的细胞内生活方式还使其检测和治疗变得复杂，并有助于其在受感染宿主体内的持续存在。因此，BKD对水产养殖系统中的养殖鱼类构成了健康威胁。在虹鳟鱼中，该疾病在实验条件下的研究较少，目前尚缺乏研究宿主-病原体相互作用的实验模型。
我们证明了共居暴露可以有效地在虹鳟鱼中传播R. salmoninarum，模拟了自然的水平传播动态，其中通过腹腔注射被感染的鱼作为传播源。感染后，这些鱼表现出高细菌载量、组织病理学上的肾脏病变以及存活率下降。体内实验再现了共居鱼中的亚临床感染阶段，其特征是qPCR检测到中等水平的细菌，在12周的实验期间偶尔能在SKDM琼脂上重新分离出细菌，出现轻微的肾脏病变，但没有明显的BKD症状。
我们进一步证实R. salmoninarum的感染发展受温度调节。在共居鱼中，较低的温度（6°C）与实验后期活细菌的更高重新分离率相关，在被感染的鱼中，则表现为存活率下降的延迟。为了补充感染监测，还应用了针对性的环境DNA分析来检测水中的细菌DNA。总体而言，这些发现强调了使用多种方法来全面了解R. salmoninarum感染的重要性。
引言
Renibacterium salmoninarum是一种革兰氏阳性细菌，能够感染全球淡水和海水中的养殖和野生鲑科鱼类（Banner等人，1986年；Faisal等人，2012年；H. Jonsdottir等人，1998年；Murray等人，2012年；Suzuki等人，2017年），是细菌性肾病（BKD）的致病菌。R. salmoninarum主要是一种细胞内病原体，能够在吞噬细胞内存活和复制（Gutenberger等人，1997年）。它可以通过水平传播（Balfry等人，1996年）和垂直传播（Brown等人，1990年）进行传播，其中真正的垂直传播是通过受感染的卵进行的，这使得细菌能够逃避标准的消毒程序（Evelyn等人，1984年）。因此，即使有标准的生物安全措施，垂直感染的卵也会成为R. salmoninarum进入水产养殖系统的风险（Bregnballe，2022年）。这种细菌的细胞内生活方式也使得抗生素治疗变得复杂；此外，目前还没有疫苗被证明能够完全有效地控制或根除这种疾病（Elliott等人，2014年；Sudheesh等人，2007年）。迄今为止，疾病的预防和控制依赖于严格的生物安全措施、有针对性的监测以及提供特定无病原体（SPF）的鱼类。
R. salmoninarum常常引发慢性感染，这些感染偶尔会发展成临床BKD，表现为缓慢发展的肉芽肿性炎症（Evenden等人，1993年；Fryer和Sanders，1981年）。感染后，鱼可能会保持感染状态并成为终生的无症状携带者，成为病原体的储存库（Banner等人，1986年；Suzuki等人，2017年）。R. salmoninarum感染的慢性及亚临床性质，加上细菌在鱼组织和器官中的不均匀分布（Austin和Rayment，1985年；Balfry等人，1996年；Suzuki等人，2017年）以及其苛刻的生长要求（Hirvel?-Koski等人，2006年），给诊断带来了挑战，尤其是在检测亚临床感染方面（Faisal等人，2012年；Hirvel?-Koski等人，2006年；Murray等人，2012年；Murray等人，2011年；Pascho等人，2002年；Suzuki等人，2017年）。R. salmoninarum的检测方法经常显示出不一致的结果（Bruno等人，2007年；Elliott等人，2013年；Griffiths等人，1996年；Pascho等人，2002年），因此建议使用多种方法来全面了解感染情况（Griffiths等人，1996年；Gudmundsdóttir等人，2017年；Murray等人，2012年；Riepe等人，2023年）。尽管R. salmoninarum不在水中自由生存，但它会通过鱼的粪便排出，并且可以在沉积物中存活至少21天（Austin和Rayment，1985年）。这一发现表明，粪便排放和随后与受污染的有机物接触可能构成重要的传播途径。近年来，针对水或沉积物样本中病原体DNA的环境DNA（eDNA）检测方法作为一种有前景的进展出现（Krishna等人，2025年；MacAulay等人，2021年），这种方法在瑞典河流中的沉积物中非侵入性地检测R. salmoninarum方面显示出潜力（Persson等人，2022年）。
研究表明，R. salmoninarum感染对全球鱼类生产有害。在丹麦，自1997年首次发现以来（Lorenzen等人，1997年），BKD对丹麦虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）的生产构成了威胁（Bregnballe，2022年）。为此，该行业已转向陆基循环水养殖系统（RAS），以减少向环境中的氮和磷排放（Bregnballe，2022年）。虽然在RAS中一致实施严格的生物安全措施可以维持无疾病的设施，但如果这些措施失败或没有得到适当遵守，病原体仍可能进入；一旦建立，它们将难以根除（Dr?nen等人，2022年；Noble和Summerfelt，1996年）。
环境压力因素会影响鱼类的疾病发展，其中水温尤为重要。作为变温动物，鱼类无法调节自己的体温，这使得它们的免疫反应高度依赖于周围环境；此外，温度还会影响病原体的复制速率（Derome等人，2016年；Guijarro等人，2015年）。在R. salmoninarum的实验感染研究中，较高的温度与虹鳟鱼（Salvelinus confluentus）和大西洋鲑鱼（Salmo salar）的早期死亡率增加相关（Jones等人，2007年；Rozas-Serri等人，2020年），而较低的温度则与BCD发展缓慢相关，从而增加了奇努克鲑鱼（Oncorhynchus tshawytscha）和大西洋鲑鱼（Purcell等人，2016年；Rozas-Serri等人，2020年）中细菌的水平传播潜力。尽管R. salmoninarum在体外复制的最佳温度为15°C（Fryer和Sanders，1981年），但BCD暴发发生在不同的季节和温度范围内（Sanders等人，1978年）。在丹麦，通过对一个虹鳟鱼养殖场的持续监测，发现在冬季R. salmoninarum在虹鳟鱼中的检出率更高（S?rensen等人，2024年）。然而，温度对虹鳟鱼中R. salmoninarum感染的影响尚未得到探索。
通过腹腔（i.p.）注射细菌接种物，已经成功在鲑科鱼类中建立了R. salmoninarum引起的BKD，从而产生了强烈的感染反应。虹鳟鱼易受BKD影响，腹腔注射被用来实验性地证明该物种对R. salmoninarum的敏感性（Sakai等人，1991年）。然而，除了关于疾病建立和死亡率的数据外，这种物种中的宿主-病原体相互作用动态仍知之甚少（Watson等人，2023年）。虽然注射方法在产生可靠感染方面有效，但它们绕过了鱼类的自然屏障，因此不完全适合研究水平传播。为了弥补这一点，已经在一定程度上使用浸泡方法来研究R. salmoninarum在北极红鱼（Salvelinus alpinus）（Gudmundsdóttir等人，2017年）、奇努克鲑鱼（Murray等人，1992年）和虹鳟鱼（Campos-Perez等人，2000年；Watson等人，2023年）中的感染。由于剂量和时间的控制困难，很少有研究使用未感染鱼和感染鱼的共居来研究R. salmoninarum感染，但这种方法仍然是水平传播的更好类比（Murray等人，1992年）。共居方法已被用于研究奇努克鲑鱼（Murray等人，1992年）和北极红鱼（Gudmundsdóttir等人，2017）中的R. salmoninarum水平传播，但在虹鳟鱼中的研究尚缺乏，宿主-病原体相互作用和宿主物种上的感染动态仍不清楚。
在这项工作中，我们开发了一个共居模型，以研究和更好地理解R. salmoninarum感染的水平传播以及温度对R. salmoninarum感染、BKD发病和虹鳟鱼疾病发展的影响。我们在两个与环境相关的温度（6°C和12°C）下成功建立了共居实验，结合频繁采样和互补的评估方法（细菌培养、qPCR、组织病理学），以全面了解暴露鱼的感染发展情况。这使我们能够研究虹鳟鱼中R. salmoninarum感染的多个方面，包括存活率下降、暴露鱼肾脏中的感染动力学、通过针对性的eDNA分析进行病原体监测、感染的慢性以及临床和组织病理学变化的发展。据我们所知，这项研究是通过共居方法首次对虹鳟鱼中的R. salmoninarum感染进行实验建模的。
部分摘录
细菌分离株和培养条件
R. salmoninarum菌株2021–1446-4B是从2021年丹麦一个虹鳟鱼RAS养殖场发生的临床暴发中分离出来的。诊断调查确定了多种病毒和细菌病原体。R. salmoninarum通过ELISA和PCR在该养殖场的多个样本中被检测到，尽管只有其中一个鱼样本中的细菌生长呈阳性（表S1），从中制备了纯培养物并保存在?80°C。该分离株是从?80°C的储存库中恢复的
存活率
首次死亡事件发生在感染后21天（dpi），在12°C较高剂量组的一个被感染的鱼中记录到。在整个实验过程中，没有暴露的共居鱼或对照组鱼出现存活率下降。每组有五条被感染的鱼在第2周被提前处死（即在没有达到人道终点的情况下被牺牲），并且在第4周，由于12°C较低剂量组的采样错误，有一条鱼也被提前处死。在84 dpi时，接受注射的鱼中的累计存活率
讨论
R. salmoninarum对全球鲑科鱼类水产养殖构成了重大威胁，无论是在RAS中还是如2022年底以来挪威大西洋鲑鱼养殖场中BCD暴发的增加所证明的那样。低水平的亚临床感染使检测和控制变得复杂，并且增加了细菌引入水产养殖设施的风险，人们对细菌在环境储库中持续存在的担忧要求更深入地研究可能触发这些情况的因素
结论
这项研究揭示了三种与病原体剂量和感染方法密切相关的感染情景。被感染的鱼出现了明显的BKD，伴有严重的组织病理学变化、通过qPCR确认的高细菌载量以及在SKDM琼脂上的细菌重新分离，以及存活率下降。共居鱼主要表现出亚临床感染，其特征是细菌DNA水平波动但较低，偶尔细菌重新分离，轻微的组织病理学变化，且没有死亡。值得注意的是，低
CRediT作者贡献声明
阿莱杭德拉·维拉米尔-阿隆索（Alejandra Villamil-Alonso）：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，可视化，方法学，调查，正式分析，数据管理。洛恩·马德森（Lone Madsen）：撰写——审稿与编辑，监督，资源提供，方法学，数据管理，概念化。蒂内·M·伊伯格（Tine M. Iburg）：撰写——审稿与编辑，可视化，正式分析，数据管理。尼尔斯·约根·奥莱森（Niels J?rgen Olesen）：撰写——审稿与编辑，方法学，资金获取，概念化。尼科洛·文德拉明（Niccolò Vendramin）：撰写——审稿与
资金来源
这项工作得到了Henriksen's fund的资助（2021-05-24-153856）。此外，这项工作还得到了欧盟的Horizon Europe项目（101136346 EUPAHW）和丹麦技术大学授予的A. Villamil-Alonso博士研究项目（DTU编号102,184）的联合资助。
致谢
我们要感谢DTU Aqua在试验和初步研究期间的动物护理人员。感谢Giulia Zarantonello在过滤和水样提取方面的支持，感谢Kári Karbech Mouritsen和Jeanne Vinther在细菌学实验室中的技术协助，以及Susanne Primdahl在组织病理学切片制备方面的帮助。我们还要感谢Anders Stockmarr在数据分析和解释方面提供的宝贵建议。
这项工作
