《Microbiology Spectrum》：Counting cytoplasmic incompatibility factor mRNA using digital droplet PCR
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本研究通过开发并验证一套高灵敏度、高精度的逆转录数字液滴PCR（RT-ddPCR）检测方法，成功实现了对单个昆虫组织（如果蝇睾丸）中Wolbachia胞质不兼容关键因子cifA与cifB稀有mRNA的绝对定量，为解析CI强度变异的分子基础、优化基于Wolbachia的蚊媒病控制策略提供了强有力的工具。
一、 引言
胞质不兼容（CI）是由母系遗传的共生菌Wolbachia诱导的一种生殖表型，是其在昆虫宿主种群中广泛传播的关键驱动力。当携带Wolbachia的雄性与未携带的雌性交配时，会导致胚胎死亡；而携带Wolbachia的雌性则能抵抗这一效应。这一过程主要由两个Wolbachia基因操控：在雄性睾丸中表达的cifB基因负责引发CI，而在雌性卵巢中表达的cifA基因则负责挽救CI。在某些系统中，例如天然感染黑腹果蝇的wMel菌株，cifA也参与CI的诱导。CI的强度——即死于CI的胚胎百分比——是决定Wolbachia在宿主种群中流行程度的关键因素。研究表明，睾丸中cifB-mRNA水平通常与CI强度正相关。然而，cifB转录本丰度极低，传统逆转录定量PCR（RT-qPCR）往往需要汇集大量个体组织才能进行可靠检测，这掩盖了个体水平的变异，限制了对CI强度变异分子机制的深入理解。
二、 结果
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为低生物量样本优化RNA纯化方案
研究首先开发并验证了一种针对低生物量样本优化的RNA提取方案。采用TRIzol:氯仿相分离法，并增加乙醇再沉淀步骤以提升RNA纯度。该方案从1对到20对果蝇睾丸中提取RNA的效率稳定，平均每对睾丸可产生约52.5 ng总RNA。RNA产量与睾丸对数量呈线性正相关，但样本间的技术变异随处理组织量的增加而增大。
- 2.
评估DNA酶处理方案
基因组DNA（gDNA）污染是低丰度转录本定量中需要克服的关键挑战。研究评估了五种不同的DNA酶处理方案对去除gDNA的效果。通过凝胶电泳检测非转录区28S rDNA以及使用RT-ddPCR定量cifA和宿主参考基因β-Spec（β Spectrin）的gDNA，发现TURBO DNA酶的“严格”处理方案能完全消除gDNA污染，且不影响RNA完整性和反转录效率。
- 3.
开发通用的cif RT-ddPCR检测方法
针对wMel菌株的cifA和cifB mRNA，研究者设计了特异性引物和探针。通过Primer-BLAST分析确认，这些寡核苷酸与至少34个Wolbachia菌株（涵盖A和B两个超群）的cif基因序列具有同源性，表明该方法具有超越wMel果蝇系统的潜在广泛应用前景。
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评估RT-ddPCR液滴分群效果
研究开发了两种双重的RT-ddPCR检测方法：cif/内标（spike）和cif/参考基因（β-Spec）。cif/spike检测法通过在RNA提取前加入合成spike-in RNA，用于校正技术性变异；cif/β-Spec检测法则通过同时定量宿主内参基因β-Spec的mRNA来校正生物学变异。两种检测方法在各自的荧光通道上均能清晰区分含靶标与不含靶标的液滴群，实现了对目标分子的可靠鉴别与计数。
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验证cif/spike与cif/β-Spec RT-ddPCR检测方法的性能
通过对来自20对睾丸的cDNA进行系列稀释，验证了四种检测方法的准确性、精密度和灵敏度。所有检测方法在目标浓度与稀释因子之间均显示出极强的线性关系，证明了其在宽动态范围内的准确性。检测下限（LOD）被定义为无模板对照95%置信区间的上限，cifA检测约为1拷贝/反应，cifB检测约为1-3拷贝/反应。即使在稀释至相当于不足一对睾丸的cDNA量时，仍能可靠检测到目标分子，证实了这些方法足以对来自单个昆虫组织的稀有cif转录本进行定量。技术精密度的评估显示，随着目标分子浓度降低，变异系数（CV）有上升趋势，这符合低丰度靶标定量的预期。
三、 讨论
这些高灵敏度RT-ddPCR检测方法的建立，使得在单个昆虫组织水平上精确量化cifA和cifB mRNA成为可能。这将有力推动将分子数据（cif转录水平）与表型数据（CI强度）在个体分辨率上进行关联的研究。cif/spike检测法因其不依赖于宿主基因，预期可应用于以wMel防控登革热、寨卡病毒等蚊媒病的埃及伊蚊等非果蝇系统。此外，由于所设计的cif引物探针与众多Wolbachia菌株的cif基因同源，该方法也具备应用于研究其他重要农业害虫、畜牧业害虫及仓储害虫体内Wolbachia CI机制的潜力。当然，在应用于wMel以外的系统前，需进行预实验验证。未来，将此RNA水平的检测与已有的DNA水平ddPCR检测（用于定量Wolbachia滴度）相结合，将能更全面地揭示CI强度变异的分子机制。
四、 材料与方法
研究使用携带wMel的果蝇品系。通过解剖获取睾丸组织，使用优化后的TRIzol:氯仿相分离法提取总RNA，并采用TURBO DNA酶严格方案去除gDNA。使用SuperScript IV VILO Master Mix进行cDNA合成。针对cifA、cifB和β-Spec设计的引物探针序列见表1。RT-ddPCR反应在Bio-Rad QX200系统上进行，每个反应使用2 μL cDNA模板，最终液滴数不少于10,000个。数据分析使用QX Manager软件及R语言完成。
