重组McXyn0243木聚糖酶的发酵条件优化及其在甘蔗渣生产木寡糖中的应用

耐热木聚糖酶McXyn0243在E. coli中通过系统优化策略（单因素、PB设计、最速升法及响应面法）获得最佳表达条件：接种量2.4%、IPTG 0.4 mmol/L、pH 7、后诱导24℃/27 h、LB培养基200 rpm，酶活性达29.41 U/mL（较单因素提升4.46倍）。2L摇瓶扩试活性提升至61.55 U/mL，与挤压汽爆结合处理甘蔗渣，产木糖寡糖（XOS）282.5 mg/g，其中X2和X3占比67%，验证其高选择性。

　　

Jinghao Ma | Lin Dai | Ruiwen Cheng | Fei Xiao | Yongbo Qu | Jianshan Fu | Jianhui Wen | Rana Abdul Basit | Dafeng Yin | Guangsen Fan

中国烟草湖南工业有限公司技术中心，湖南，410000，中国

摘要

本研究旨在优化来自Malbranchea cinnamomea的耐热木聚糖酶McXyn0243在大肠杆菌中的表达。采用了单因素实验、Plackett-Burman (PB) 设计、最速上升路径设计以及响应面方法 (RSM) 设计相结合的系统策略。最终确定的最佳条件为：接种量 2.4% (v/v)、IPTG 浓度 0.4 mmol/L、pH 值 7、诱导后温度 24°C、诱导前预处理时间 9 小时、诱导后培养时间 27 小时，并在 LB 培养基中以 200 rpm 的转速进行培养。优化后的酶活性达到 29.41 U/mL，比单因素实验获得的最高活性提高了 4.46 倍。在 2 L 摇床培养瓶中进行的大规模培养进一步将酶活性提升至 61.55 U/mL。为了评估其应用潜力，将该酶与自水解工艺结合使用，成功将甘蔗渣转化为木寡糖 (XOS)，产率高达 282.5 mg/g 干物质。产物中高价值组分木二糖 (X2) 和木三糖 (X3) 的含量显著增加，两者合计占 XOS 的 67%，这凸显了该酶的优秀选择性。这些结果表明 McXyn0243 在高效生产木质纤维素生物质中的高纯度 XOS 方面具有巨大潜力。未来的工作将探索整合预处理策略，将该酶与自水解或深共晶溶剂结合，以推动该工艺向工业化应用迈进。

引言

木聚糖酶是一种能够随机水解木聚糖中 β-1,4-?-木糖苷键的酶，木聚糖是植物生物质的主要成分之一，占其含量的 20–50%（Collins 等，2005）。由于木聚糖酶具有降解木聚糖的能力，因此在食品、纺织、纸张和纸浆漂白、动物饲料、烟草、制药、环境保护、生物能源和废物处理等多个领域受到了广泛关注（Cil 等，2010；Qin 等，2022；Walk 和 Poernama，2019）。在各种木聚糖酶中，具有优异耐热性的酶因其在高温下仍能保持酶活性和稳定性而备受青睐。这种热稳定性带来了诸多优势，包括降低生产成本、提高底物溶解度、加快反应速率以及减少高温处理过程中的微生物污染（Kumar 和 Shukla，2018）。因此，开发高耐热性的木聚糖酶一直是该领域的研究重点。

耐热微生物通过产生耐热蛋白来在高温环境下生存。因此，从这类菌株中分离耐热木聚糖酶是一种有效且可行的方法。例如，从耐碱Anoxybacillus E2菌株中克隆出的木聚糖酶 XynE2在 65°C时表现出最大活性，并且在 60°C时仍具有耐热性（Wang 等，2010）。另一个例子是来自极端嗜热菌Geobacillus thermoleovorans的木聚糖酶 Xyl-gt，在 80°C时活性最佳，并且在广泛的温度范围内（40-100°C）具有很高的耐热性（Verma 和 Satyanarayana，2012）。Geobacillus thermodenitrificans的木聚糖酶也在 70°C时表现出最佳活性（Gerasimova 和 Kuisiene，2012）。腐生真菌Malbranchea cinnamomea能够在高温环境中（如堆肥中，有机物分解温度约为 50°C）茁壮生长（Zhu 等，2020）。该菌株因其产生的酶在 60–80°C范围内仍保持高活性而受到广泛研究（Fan 等，2014）。例如，Li 等（2014）和 Fan 等（2014）分别从M. cinnamomeaS168菌株中纯化了两种嗜热木聚糖酶 McXyn25 和 McXyn10。McXyn25的最佳活性温度为 65°C，在 60°C以下仍具有较高稳定性（Li 等，2014）。相比之下，McXyn10的最佳活性温度为 80°C，在 70°C时的半衰期为 76 分钟（Fan 等，2014）。鉴于这些特性，从M. cinnamomea中探索耐热木聚糖酶具有巨大潜力（Basotra 等，2018；Zhu 等，2020）。然而，目前关于M. cinnamomea来源的木聚糖酶的性质和应用的研究仍然有限。现有研究表明，该真菌属至少可以分泌四种不同分子量的木聚糖酶（25、30、45 和 77 kDa），它们之间的差异和相互关系需要进一步深入研究（Fan 等，2013）。因此，我们的研究团队计划对这些酶进行系统的比较研究。作为该系列的第一部分，本研究重点关注从白酒发酵环境中分离出的M. cinnamomea 408菌株，并详细研究了其 25 kDa 木聚糖酶（属于糖苷水解酶家族 11 的酶，命名为 McXyn0243）（Gao 等，2025；Zhong 等，2025）。具体而言，我们利用了以高速、清晰的遗传背景、低成本和短周期著称的大肠杆菌表达系统，优化了表达条件，为后续研究提供了便捷的酶源（Hayat 等，2018）。

XOS 被誉为“功能性寡糖之王”，是从玉米芯和甘蔗渣等植物纤维中提取的天然益生元（Forsan 等，2023）。其显著特点是具有很强的选择性——每天只需摄入 0.7–1.4 克即可强力促进双歧杆菌的生长（效果是果寡糖的 20–100 倍），从而精准平衡肠道微生物群，缓解便秘和腹泻（Martins 等，2023）。从生理学角度来看，XOS 低热量且对血糖影响小，因为人体没有相应的消化酶，因此对糖尿病患者安全（Zhan 等，2025）。它还有助于抑制导致蛀牙的细菌，促进钙、铁和锌等关键矿物质的吸收，并支持免疫功能（Kumari 等，2024）。由于其在酸性及高温条件（pH 2.5–8.0，最高温度 100°C）下的稳定性极佳，XOS 能够完整地到达结肠发挥作用（Martins 等，2023）。这些特性使其成为广泛应用于乳制品、饮料、烘焙食品和动物饲料中的多功能高性能成分（Abouloifa 等，2024）。因此，本研究初步探讨了利用木聚糖酶 McXyn0243和自水解工艺从甘蔗渣中生产 XOS的方法。这项研究的目的是为未来将这种酶用于农业废弃物转化奠定基础。

总之，本研究首次报道了从嗜热真菌M. cinnamomea中克隆并在大肠杆菌中优化表达糖苷水解酶家族 11 的木聚糖酶（McXyn0243）的情况。通过利用该酶的耐热性，我们证明了其在结合自水解工艺进行甘蔗渣糖化过程中的有效性。这种综合策略不仅最大化了 XOS 的产率，还为将农业废弃物转化为高价值益生元产品奠定了坚实的基础。

材料、试剂和培养基

重组载体 pET-22b-McXyn0243 已成功构建，并转化到大肠杆菌 BL21(DE3) 中，随后保存在我们的实验室（Gao 等，2025）。山毛榉木聚糖和抗生素氨苄西林购自北京 Mreda。甘蔗渣由德宏戴和景坡自治州糖业研究所提供。以下试剂从 Sigma Chemical Company（圣路易斯，密苏里州）购买：木糖、木二糖（X2）、木三糖（X3）、木四糖

培养基类型

先前的研究比较了在大肠杆菌 BL21(DE3)中常用的各种异源蛋白表达培养基，评估了它们对表达效率的影响。研究结果表明，最佳培养基因具体异源蛋白的不同而有所差异。例如，LB 培养基是生产 BpFae^T132C-D143C（阿魏酰酯酶）的最佳培养基，而 SOB 培养基则更适合 BpFae（阿魏酰酯酶）的生产，TB 培养基

结论

本研究首次系统地优化了来自M. cinnamomea的耐热木聚糖酶 McXyn0243在大肠杆菌中的表达条件，使酶活性达到 29.41 U/mL，比单因素实验的最大活性提高了 4.46 倍。在 2 L 摇床培养瓶中进行的大规模培养进一步将酶活性提升至 61.55 U/mL。当将其与甘蔗渣自水解工艺结合使用时，总 XOS 产率达到了 282.5 mg/g 干物质

CRediT 作者贡献声明

Jianhui Wen： 软件开发、数据管理。 Jianshan Fu： 软件开发、数据管理。 Dafeng Yin： 监督、资金筹措。 Rana Abdul Basit： 文章撰写、审稿与编辑。 Ruiwen Cheng： 项目管理。 Lin Dai： 文章撰写、审稿与编辑。 Yongbo Qu： 文章撰写、审稿与编辑。 Fei Xiao： 方法学研究、概念设计。 Jinghao Ma： 项目管理。 Guangsen Fan： 文章撰写、初稿撰写、监督、资金筹措

未引用的参考文献

Sluiter 等，2004。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。

数据可用性

数据可应要求提供。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国烟草湖南工业有限公司 2024 年年度科技创新活动项目（KY2024CG0026）的资助；同时得到了北京自然科学基金（6222003）的支持。