PACAP/PAC 1 通过 ipRGC-VLPO 通路调节光诱导的睡眠

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：PACAP/PAC 1 Modulates Light-Induced Sleep via the ipRGC-VLPO Pathway

PACAP通过调控VLPO神经元兴奋性参与光诱导睡眠机制研究。通过体内EEG、免疫组化及离体电生理实验，发现PACAP1-38能增强VLPO中间神经元活性并抑制睡眠促进神经元，显著提升光诱导的REM睡眠。实验证实ipRGCs通过释放PACAP激活PAC1受体介导的VLPO通路，调控昼夜节律与睡眠-觉醒周期。

　　

王伟鹏|张园|李琳|徐耀阳|张文博|陈向民|王学杰|童光安|张平平

安徽医科大学基础医学院生理学系，中国合肥

摘要

光可以诱导睡眠。许多研究表明，内在光敏性视网膜神经节细胞（ipRGCs）和腹外侧视前区（VLPO）通路介导了光诱导的睡眠。ipRGCs可以释放垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACAP），该肽参与调节昼夜节律。先前的研究表明PACAP与睡眠密切相关，但PACAP对光诱导睡眠的影响尚未被报道。为了研究PACAP在ipRGC–VLPO光诱导睡眠中的作用，本研究采用了体内脑电图记录、免疫组织化学和体外电生理记录方法。通过免疫组织化学实验，我们发现PACAP及其受体PAC1在VLPO中广泛表达。利用微透析技术将PAC1激动剂PACAP 1-38注入VLPO，结果显示小鼠的睡眠时间增加，包括快速眼动（REM）睡眠时间延长，清醒时间减少。通过脑片膜片钳技术，我们发现PACAP 1-38增加了VLPO中间神经元的兴奋性，同时抑制了促进睡眠的神经元的兴奋性。通过眼内注射saporin（SAP）部分破坏ipRGCs后，我们继续观察PACAP对光诱导睡眠的影响。结果表明，在SAP小鼠的VLPO中注射PACAP 1-38后，其光诱导睡眠时间增加，尤其是REM睡眠时间显著延长。这些结果表明PACAP参与了ipRGC–VLPO介导的光诱导睡眠。

引言

内在光敏性视网膜神经节细胞（ipRGCs）表达黑视蛋白（melanopsin），这是一种具有G蛋白偶联受体特性的光敏性视蛋白分子，能够通过激活黑视蛋白直接感知光刺激；因此，它被认为是视网膜中的第三种光感受器类型，除了杆状细胞和锥状细胞[1]，[2]。ipRGCs具有广泛的投射，包括视交叉上核（SCN）、腹外侧视前区（VLPO）以及其他与非视觉功能密切相关的核团。它们参与调节生物节律、瞳孔光反射、睡眠和清醒周期等生理功能[3]，[4]。

研究表明，ipRGC–视前区（POA）通路的激活可以导致小鼠出现光诱导睡眠，并主要增加非快速眼动（NREM）睡眠[5]。在特定的黑视蛋白敲除小鼠中，无法诱导急性光脉冲引起的睡眠变化[6]。在黑视蛋白敲除小鼠中，杆状细胞和锥状细胞可以增加初始睡眠，但不能产生持续的光响应，且光可以抑制小鼠的活动[7]。在啮齿动物中，ipRGCs和VLPO之间存在直接联系[8]。作为POA中重要的促进睡眠区域，VLPO可能参与了ipRGC介导的光诱导睡眠。

垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACAP）属于血管活性肠肽/胰高血糖素/分泌素家族，是一种由27或38个氨基酸组成的神经肽[9]。PACAP在中枢和周围神经系统中广泛表达，调节多种生理功能[10; 11; 12; 13; 14; 15; 16]，包括昼夜节律、睡眠-清醒周期、进食行为和代谢。研究表明，PACAP可以减少清醒时间并延长睡眠时间，特别是增加快速眼动（REM）睡眠时间[17]。值得注意的是，PACAP在大鼠的桥脑网状结构和中脑中高度表达，其激活会导致REM睡眠时间显著延长[18]。类似地，在人类中也观察到了PACAP诱导的促睡眠效应。例如，患有帕金森病相关睡眠障碍的患者血液中的PACAP水平明显低于健康对照组，而嗜睡症患者的PACAP表达升高[19]。有趣的是，ipRGC末端可以释放谷氨酸和PACAP，但这些神经递质之间的相互作用及其对VLPO介导的睡眠调节的联合效应尚不清楚。

我们的研究表明，PACAP及其受体PAC1在VLPO脑区中显著表达。利用小鼠的体内脑电图记录系统监测了睡眠模式的变化。通过在VLPO预先植入微透析导管，在光照开始2小时后给予PAC1受体激动剂PACAP 1-38，发现REM睡眠时间显著增加，清醒时间减少。通过脑片膜片钳技术，我们研究了PACAP对VLPO神经元兴奋性的影响。PACAP 1-38的给药增加了中间神经元的兴奋性，同时抑制了促进睡眠的神经元的兴奋性。将选择性破坏ipRGCs的免疫毒素melanopsin–saporin（MEL–SAP）注射到小鼠的眼睛中，从黑暗开始1小时后暴露于光下3小时，这些小鼠的光诱导睡眠减少。随后通过VLPO微透析导管给予PACAP 1-38，结果显示清醒时间减少，光诱导睡眠时间增加，尤其是REM睡眠时间显著延长。这些结果表明，PACAP/PAC1信号通路可能在ipRGC–VLPO电路介导的光诱导睡眠调节中起作用。

实验部分

动物

本研究使用了7-8周大的C57BL/6J雄性小鼠。实验遵循1996年修订的美国国立卫生研究院关于实验室动物护理和使用的指南（NIH出版物编号80-23）以及安徽医科大学关于动物伦理使用的规定（项目编号LLSC20180356）。我们尽一切努力减少使用的动物数量和它们的痛苦。

组织制备

对小鼠进行称重并麻醉（腹腔注射）

PAC1受体在VLPO神经元中显著表达

PACAP在外周和中枢神经系统广泛表达，并根据目标组织中受体亚型的不同表达而产生不同的效应。PACAP通过与三种不同的G蛋白偶联受体PAC1、VPAC1和VPAC2结合来发挥其多种效应[20]，[21]。我们使用RT-PCR和免疫荧光染色技术检测了VLPO中PACAP受体的表达情况。

讨论

PACAP在中枢神经系统中广泛分布[27; 28]，在多种生理功能中发挥关键调节作用，包括消化、排尿、代谢、神经保护和睡眠[29; 30]。利用分子生物学技术，如免疫荧光染色和RT-PCR，我们检测了VLPO中PACAP受体的表达情况。结果表明，PAC1受体在VLPO区域显著表达，主要位于神经元的细胞体和细胞质中

作者贡献声明

王学杰：方法学、数据分析、数据管理。童光安：方法学、数据分析、数据管理。张平平：写作——审稿与编辑、初稿撰写、监督、资源获取、数据分析、概念构思。李琳：实验设计、数据分析、数据管理。徐耀阳：方法学、数据分析、数据管理。张文博：方法学、数据分析、数据管理。陈向民：方法学、数据分析、数据管理。王伟鹏：写作

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可向通讯作者索取。本研究的补充数据可在以下链接公开获取：https://doi.org/10.6084/m9.figshare.30325279.v1

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（81801317）、安徽省自然科学基金（1808085QH277）和安徽省高等学校自然科学基金（2022AH050752, 2025AHGXSK30094）的资助。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。