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CD19靶向的CAR-T疗法通过计算设计优化单链抗体，结合PSI-BLAST验证、分子对接、机器学习预测毒性和分子动力学模拟，成功开发出高亲和力且稳定的H8_L1 scFv，其抗抗原逃逸能力显著，为降低脱靶效应和提升疗效提供新框架。
Kadalmani Krishnan | Anita Chugh | Ravikrishnan Rajaram | Anagha S. Setlur | Chandrashekar Karunakaran | Akshay Uttarkar | Vidya Niranjan
Thrafford Lifescience, BSC BioNEST Bio-Incubator (BBB), Regional Centre for Biotechnology, Faridabad, Haryana 121001, India
摘要：
嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法彻底改变了B细胞恶性肿瘤的治疗方式，其中CD19成为主要靶点，因为其在淋巴瘤中的表达稳定。然而，当前的CAR-T疗法面临抗原逃逸、治疗耐药性和毒性的挑战。在这项研究中，我们采用计算方法设计和优化基于scFv的受体，以降低其脱靶相互作用的可能性。我们利用了计算机模拟技术，包括PSI-BLAST序列验证、分子对接、基于机器学习的毒性预测和分子动力学模拟，来完善ScFv相关受体的设计。我们的结构建模和对接研究确定了一种优化的单链可变片段（scFv）抗体（H8_L1），该抗体对野生型和突变型CD19变体都表现出高结合亲和力和稳定性。毒性评估显示其脱靶效应极小。此外，计算突变对接研究显示，这种优化的基于scFv的受体在抗原变异的情况下仍能保持稳定的相互作用。这些发现为CAR-T受体的设计提供了有力的优先级研究和框架，提高了计算效率并降低了毒性，为进一步的实验验证和临床应用铺平了道路。然而，这项工作仅限于计算scFv设计，并未评估CAR表达、表面定位或T细胞功能。
引言
淋巴瘤是一个重大的全球健康问题，仅非霍奇金淋巴瘤（NHL）就占全球所有癌症的约4%。美国癌症协会估计，2023年全球将有约81,560例新发NHL病例和8,830例新发霍奇金淋巴瘤病例。这些统计数据突显了淋巴瘤对患者和医疗系统的巨大负担，包括身体、情感和经济方面的挑战。由于现有疗法的局限性，有效的治疗方案至关重要。传统的治疗方法如化疗、放疗和干细胞移植往往伴随着显著的副作用，包括免疫抑制和感染风险增加。此外，相当比例的患者会复发或对这些治疗产生耐药性。例如，大约30-40%的弥漫大B细胞淋巴瘤患者会出现复发或难治性疾病，导致预后不良和生存率降低。淋巴瘤治疗的进步，特别是CAR-T细胞疗法的发展，显示出改善患者预后的巨大潜力。针对CD19的CAR-T细胞疗法在复发或难治性B细胞淋巴瘤患者中表现出令人印象深刻的反应率，一些研究报道的完全缓解率高达60%。CD19是一种I型跨膜糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族，存在于正常和肿瘤B细胞上。它调节B细胞激活的阈值并放大B细胞受体信号传导。CD19在成熟B细胞发育中起着关键作用，CD19缺陷的小鼠表现出成熟B细胞数量显著减少。它通过调节B细胞受体依赖性和非依赖性信号传导，在建立内在B细胞信号传导阈值中起着关键作用。CD19与补体受体CD21、四跨膜蛋白CD81（TAPA-1）和CD225一起，作为成熟B细胞表面的多分子复合体的主要信号成分。其表达从pro-B细胞阶段持续到浆母细胞阶段，在B细胞发育和功能中起着重要作用。CD19将信号从B细胞受体和成熟B细胞中的受体（如CXCR4）传递出去。在淋巴瘤中，CD19在B细胞上的稳定表达使其成为有吸引力的治疗靶点。它不会释放到循环系统中，为恶性细胞提供了一个一致的标记。针对CD19的疗法，包括单克隆抗体、双特异性抗体和CAR-T细胞疗法，在治疗滤泡性淋巴瘤和其他B细胞恶性肿瘤方面显示出希望。临床研究记录的总体反应率在50%到100%之间，完全缓解率在20%到66.7%之间。然而，由于抗原丢失和淋巴瘤的异质性，复发仍然需要持续的研究来识别额外靶点并改进治疗策略。总之，CD19的特性及其在B细胞功能中的重要作用凸显了其在淋巴瘤生物学和治疗中的重要性。针对CD19的研发一直是开发有效B细胞淋巴瘤治疗方法的重点。
CAR-T细胞疗法的开发涉及改造T细胞以表达能够识别肿瘤细胞上特定抗原的嵌合抗原受体，例如B细胞淋巴瘤上的CD19。该过程首先从患者体内分离T细胞，然后进行基因改造以引入CAR结构。该结构包括一个通常来自抗体单链可变片段（scFv）的细胞外抗原结合域、一个跨膜域以及细胞内信号域，这些信号域在抗原结合时激活T细胞。选择CD19作为靶抗原是策略性的，因为其在B细胞恶性肿瘤中表达稳定，并且在B细胞发育中起作用。针对CD19的CAR-T细胞在临床试验中表现出显著的效果，使复发或难治性淋巴瘤患者得到了显著的反应。
设计针对CD19的抗体需要仔细的结构考虑，以确保高特异性和亲和力。该过程从选择合适的抗体骨架开始，通常优先选择人源化或全人源抗体以减少免疫原性。计算建模预测抗体的可变区域如何与CD19相互作用，从而设计出能够紧密且特异性地结合抗原的抗体。表位映射确定了CD19上的精确结合位点，这对于设计能够有效靶向恶性B细胞而不影响正常细胞的抗体至关重要。分子对接和计算突变等技术有助于确定这些表位并优化抗体-抗原相互作用。通过亲和力成熟等优化策略来提高抗体的特异性和稳定性。
嵌合抗原受体是模块化结构，其中抗原结合的单链可变片段（scFv）作为一个独立的识别单元，可以在整合到CAR框架之前进行设计和优化。由于抗原特异性、亲和力和抗原逃逸的敏感性主要由scFv-抗原界面控制，因此在scFv水平上的计算优化是CAR-T开发中的关键上游步骤。因此，本研究侧重于计算机模拟设计、稳定性分析和突变耐受性分析，作为未来CAR-T工程的准备阶段，而不是评估CAR表达或T细胞功能。
因此，在本研究中，我们根据表达谱针对CD19抗原，并使用计算机模拟技术预测CD19的结构，然后进行环结构优化和结构验证。进行了重链、轻链和连接部分的预测，并通过抗原-抗体对接验证了结合亲和力。我们通过诱导报道的CD19突变并验证抗体结合来巩固我们的研究。CDR移植和人源化增加了设计的抗体的价值，并提供了额外的结合准确性。因此，这项工作侧重于CD19结合scFv的计算设计和优先级排序，作为未来CAR-T工程的准备步骤，而不是CAR表达或T细胞功能的验证。
章节摘录
蛋白质序列的获取
设计CAR-T受体的第一步是获取相关的蛋白质序列。具体来说，从专利（编号：WO2014153270A1, WO2019159193A1）中提取了CAR-T受体所有链的序列。选择这些序列是基于它们在之前的CAR-T细胞疗法设计中的已知功能以及它们在靶向CD19（一种常见的B细胞抗原）方面的相关性。本研究使用的起始序列在补充数据S1中提供。
蛋白质序列获取和结构建模
从诺华公司的印度专利中初步选择的重链和轻链序列使用PSI-BLAST与主要蛋白质数据库（NR、SwissProt/UniProt、PDB）进行了比对。这种方法确保只考虑了具有高一致性、低E值和显著查询覆盖率的序列。使用ImmuneBuilder进行的计算建模生成了400个抗体结构，这些结构进一步进行了对接分析。图1展示了建模抗体的3D表示
讨论
淋巴瘤，特别是非霍奇金淋巴瘤（NHL）和弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL），由于高复发率和对化疗和放疗等传统疗法的耐药性，仍然构成重大的临床挑战。嵌合抗原受体（CAR）-T细胞疗法的出现，特别是针对CD19的疗法，显著改善了患者预后，完全缓解率可达60%。然而，当前的CAR-T疗法仍存在局限性...
结论
本研究展示了计算建模作为设计和优先选择与CAR-T受体开发相关的CD19靶向单链可变片段（scFv）的合理框架的实用性。通过关注scFv水平的结合稳定性和突变耐受性，该方法解决了与抗原变异性相关的关键问题，而无需假设CAR表达或T细胞功能。重要的是，这项工作旨在作为计算优先级...
CRediT作者贡献声明
Chandrashekar Karunakaran：写作 - 审稿与编辑、原始草稿撰写、可视化、软件开发、形式分析、数据管理。Akshay Uttarkar：写作 - 审稿与编辑、可视化、方法学、形式分析、数据管理。Vidya Niranjan：资源获取、项目管理、方法学、研究、概念化。Kadalmani Krishnan：项目管理、方法学、研究、资金获取、概念化。Anita Chugh：监督、方法学...
利益冲突
作者Kadalmani Krishnan、Anita Chugh和Ravikrishnan Rajaram是印度哈里亚纳邦Faridabad的Thrafford Lifescience, BSC BioNEST Bio-Incubator (BBB)的员工。其余作者声明没有利益冲突。
伦理声明
本研究未涉及任何临床试验，也未涉及人类/动物实验。
资助
这项研究工作由Thrafford Lifescience、BSC BioNEST Bio-Incubator (BBB)、Regional Centre for Biotechnology（印度哈里亚纳邦Faridabad 121001）资助。
利益冲突声明
? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：作者Kadalmani Krishnan、Anita Chugh和Ravikrishnan Rajaram是印度哈里亚纳邦Faridabad的Thrafford Lifescience, BSC BioNEST Bio-Incubator (BBB)的员工。其余作者声明没有利益冲突。
这项研究工作由Thrafford Lifescience, BSC BioNEST Bio-Incubator (BBB)资助...
致谢
作者感谢R V工程学院的实习生Bhavyashree和Sunidhi在初步数据收集方面的帮助。
