通过Halomonas campaniensis G菌株优化发酵条件及进行分批补料生产ectoine的过程 9-72

通过紫外线诱变获得的高产突变株Halomonas campaniensis G9-72，结合响应面法优化发酵条件（1.37 mol/L NaCl，37 mmol/L MSG，35.8℃），批次发酵产ectoine达2.93 g/L，补料发酵至88小时提升至3.78 g/L，较野生株提高7.7倍。

　　

作者：石博涵、薛斌娟、陶玉洁、徐荣、李永珍、韩睿、王蓉、朱德瑞

单位：中国青海省西宁青海大学医学院基础医学科学研究中心，邮编810016

摘要

ectoine是一种由耐盐细菌产生的有价值的相容性溶质，用于渗透保护，并被应用于制药和化妆品领域。然而，其工业生产常常受到微生物菌株发酵性能的限制。在本研究中，我们使用了一种高产突变株Halomonas campaniensis G₉-72（通过野生型菌株XH26的反复紫外线诱变获得），并优化了ectoine的发酵工艺。首先通过单因素实验评估了关键因素，然后应用Plackett-Burman筛选法和Box-Behnken设计，利用响应面方法进一步优化了发酵过程。最佳条件为：NaCl浓度1.37 mol/L、味精（MSG）浓度37 mmol/L、温度35.8 ℃。在这些条件下，批次发酵产生的ectoine含量为2.93 ± 0.01 g/L。采用补料批次发酵策略后，88小时时ectoine的最大含量提高到3.78 ± 0.02 g/L，比批次发酵的最大值高出1.30倍。这些结果表明，发酵优化与补料策略的结合显著提升了H. campaniensis G₉-72的ectoine产量，为其工业生物生产奠定了坚实的基础。

引言

ectoine是一种相容性溶质，主要由嗜盐和耐盐微生物合成，以维持渗透平衡并抵抗高温、高盐度和干旱等压力条件[1]。在Halomonas属细菌中，ectoine以天冬氨酸半醛（ASA）为底物，通过由基因ectB、ectA和ectC编码的酶EctB、EctA和EctC催化的一系列酶促反应生成[2]。传统的ectoine生产主要依赖于大规模工业发酵，但产量常常受到菌株性能的限制。为了开发更优的发酵菌株，许多研究人员采用了物理/化学诱变、基因工程、基因编辑和细胞系统代谢工程等策略[3]、[4]、[5]。例如，李等人将Halomonas venusta的ectABC基因簇导入E. coli BL21中，获得了1.70 g/L的ectoine产量[6]；张等人将H. venusta ZH的ectABC基因簇导入E. coli中，并通过红重组技术敲除了lysA、thrA和pta基因，消除了赖氨酸和丙酮酸的代谢分流，使得工程菌株在发酵罐中的ectoine产量达到10.20 g/L[7]。 微生物菌株通常是工业应用的核心，结合最佳培养条件和高性能菌株是实现大规模生产的关键[8]、[9]。ectoine的大规模工业生产主要通过微生物发酵实现，包括批次发酵、补料批次发酵和连续发酵。目前，批次发酵和补料批次发酵是最常用的方法，因为它们操作简单且易于控制。例如，陈等人使用2.0 L生物反应器对Halomonas salina DSM5928进行批次发酵，获得了2.53 g/L的ectoine产量，高于摇瓶培养的1.78 g/L[10]；赵等人敲除了Halomonas hydrothermalis Y2中的ectD和doeA基因，降低了ectoine的代谢速率，突变株ET11在补料批次发酵下的产量达到了10.5 g/L，远高于摇瓶发酵的1.91 g/L[11]。在我们之前的工作中，我们对野生型Halomonas campaniensis XH26（ectoine产量为491.19 mg/L）进行了反复紫外线诱变，获得了遗传稳定的突变株G₉-72，该突变株生长和代谢速度更快，ectoine产量显著提高，显示出大规模生产的潜力。 本研究重点关注G₉-72菌株，分析了盐浓度、pH值、温度、味精（MSG）和溶解氧（DO）等单个因素的最佳条件。通过Plackett-Burman和Box-Behnken方法确定了影响ectoine积累的关键变量，并确定了最佳发酵条件。此外，还采用了补料批次发酵进一步验证了ectoine的产量，其最大产量达到了3.78 g/L，比原始菌株H. campaniensis XH26提高了7.7倍。本研究为后续的ectoine大规模发酵生产提供了宝贵的参考。

细菌菌株和化学品

野生型Halomonas campaniensis XH26（CCTCC M2019776M）和突变株Halomonas campaniensis G₉-72（CCTCC M2019777^M）保存在中国青海大学基础医学科学研究中心。发酵基础培养基包含NaCl（58.50 g/L）、KCl（55.88 g/L）、MgSO₄·7H2O（24.65 g/L）、MSG（6.50 g/L）、柠檬酸钠（3.00 g/L）、酪蛋白酶解物（7.50 g/L）、无水CaCl₂（0.20 g/L）和酵母提取物（2.00 g/L），以及0.20%（体积比）的消泡剂。培养基在121 ℃下灭菌。

突变株在摇瓶和批次发酵中的生长特性比较

如图1a（表S1）所示，突变株G₉-72在摇瓶发酵4小时时进入对数生长阶段，20小时后生长速度减缓，52小时时生物量达到峰值1.89 g/L。如图1b（表S2）所示，在批次发酵中，菌株在8小时时开始对数生长。0至48小时内，溶解氧（DO）从30%下降到19.8%，pH值从8.0降至7.5。随后，48小时后DO和pH值有所恢复，表明进入减速生长阶段。

控制Halomonas属细菌生物量形成和ectoine合成的因素

Halomonas的生长和次级代谢产物的合成受到发酵培养基组成（如盐浓度、碳/氮源的种类和浓度）及培养条件（如温度、pH值和DO）等因素的显著影响。基于单因素实验的结果，本研究利用Plackett-Burman设计确定了影响G₉-72菌株细胞内ectoine积累的三个关键因素：NaCl浓度和温度。

结论

Plackett-Burman设计确定NaCl浓度、温度和MSG浓度是影响Halomonas campaniensis G₉-72菌株ectoine产量的关键因素。通过Box-Behnken设计的响应面优化，确定了最佳培养条件：NaCl浓度1.37 mol/L、MSG浓度37 mmol/L、温度35.8 ℃。在这些条件下，批次发酵产生的ectoine产量为2.93 g/L；补料批次发酵在88小时时将最大产量提高到3.78 g/L，比批次发酵高出1.30倍。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号32260019）和青海省人民政府地方科技发展引导基金项目（2024ZY015）的支持。

CRediT作者贡献声明

韩睿： 资金筹集。 徐荣： 监督、方法学指导。 李永珍： 监督、实验研究。 石博涵： 文稿撰写——初稿撰写。 薛斌娟： 文稿撰写——初稿撰写。 陶玉洁： 软件开发、数据管理。 王蓉： 数据可视化、监督。 朱德瑞： 文稿修订与编辑、项目管理。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。