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心肌缺血再灌注损伤中外泌体通过miR-155-5p靶向Nfe2l2通路促进心肌细胞铁死亡，抑制该通路或外泌体可改善心脏功能。
Xinyu Ge|Qingshu Meng|Jing Liu|Enhao Wang|Xuan Liu|Shanshan Shi|Xin Gong|Zhongmin Liu|Wei Han|Xiaohui Zhou
上海同济大学医学院上海东方医院转化医学研究中心，中国上海200120
摘要
背景
缺血-再灌注（IR）损伤是心肌梗死后细胞死亡的主要原因之一。铁死亡（Ferroptosis）是一种新发现的、依赖于铁和活性氧（ROS）的调控性细胞死亡（RCD）形式。我们最近证实，心脏IR会触发细胞外囊泡（EVs）的释放增加，从而加重心脏功能障碍。这些EVs是否以及在心肌梗死IR损伤过程中如何促进心脏铁死亡，目前仍不清楚。
方法
通过结扎左前降支冠状动脉45分钟然后进行再灌注，建立了小鼠心肌IR模型。随后分离出来自受IR影响的心脏的EVs（IR-EVs）。我们使用qPCR、WB和miRNA测序等方法，在细胞和动物水平上进一步证实了IR-EVs对心肌细胞铁死亡的影响。
结果
通过移植物转移实验和EVs抑制实验确认，IR-EVs是导致心肌细胞铁死亡的重要因素，表现为Ptgs2表达增加、丙二醛（MDA）生成增多以及NADPH水平下降。此外，IR-EVs中富集的miR-155-5p能够被传递到心肌细胞中，并促进心肌细胞在氧化应激下的铁死亡。通过荧光素酶报告基因实验进一步证实Nfe2l2是miR-155-5p的靶基因。一致地，靶向Nfe2l2的分子能够调节H2O2或氧葡萄糖剥夺/再氧化（OGD/R）诱导的铁死亡，涉及Nfe2l2通路的下游抗氧化反应元件（AREs），包括Nqo1、HO1、Fth1和Slc7a11。
结论
本研究揭示了心脏IR损伤中一种新的基于EV的铁死亡调控机制。针对IR-EVs-miR-155-5p-Nfe2l2轴的策略可能具有治疗潜力，有助于预防心肌梗死后的心脏铁死亡和功能障碍。
引言
缺血性心脏病仍然是全球主要的死亡原因之一。尽管急性心肌梗死的治疗技术（如经皮冠状动脉介入和冠状动脉旁路移植）取得了进展，但心肌缺血-再灌注（IR）损伤仍然是临床上的常见问题，会导致心脏功能障碍并最终发展为心力衰竭。
先前的研究发现，导致细胞死亡的主要途径（包括凋亡、坏死性和铁死亡）是心肌IR损伤的原因[1,2]。已经证实，防止梗死周围区域的细胞死亡可以保护心脏功能[3]。因此，研究心肌IR损伤过程中的细胞死亡机制具有重要意义。
铁死亡是一种新发现的调控性细胞死亡（RCD），其特征是铁依赖性的脂质过氧化物积累，可能由谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的损伤引起[4]。与铁死亡密切相关的生化变化包括脂质过氧化[5]、Ptgs2的高表达（作为铁死亡的标志物[6]）以及NADPH水平降低[7]。新兴证据表明，铁死亡参与了肝脏[6]和心脏[8,9]的IR损伤。铁死亡抑制剂（如铁螯合剂和谷氨酰胺酶抑制剂）可以保护小鼠心脏免受IR损伤[10]。然而，心脏铁死亡的具体触发和调控机制仍不完全清楚。阐明IR诱导的铁死亡分子机制可能为临床干预提供新的靶点。
细胞外囊泡（EVs）是存在于各种生物液体中的纳米级细胞来源的膜状囊泡[11]。EVs能够传递蛋白质、脂质和RNA等多种分子[12]，被认为是体内细胞间通讯的关键介质。研究表明，这些高度异质的纳米级囊泡参与了心脏的病理生理过程。我们最近发现，由IR诱导的心脏内EVs（IR-EVs）会促进心脏的炎症反应，并且这些EVs含有特定的miRNAs[13]。已有报道指出，miRNAs在调节不同类型的细胞死亡中起关键作用。先前的研究表明，缺氧刺激后心肌细胞分泌的EVs含有特定的miRNAs，这些miRNAs可以诱导周围细胞的凋亡和自噬[14,15]。其他研究也证实了miRNAs在各种病理过程中的铁死亡中的作用[16,17]。因此，我们推测IR-EVs可能通过传递其携带的miRNAs来调节心肌细胞的铁死亡。
在这里，我们发现了心脏IR损伤中一种新的基于EV的铁死亡调控机制。我们的体外和体内研究表明，IR-EVs能够将miR-155-5p传递到心肌细胞中，并通过靶向Nfe2l2通路促进IR诱导的铁死亡。本研究为IR损伤中的病理机制提供了新的见解，并指出了针对IR-EVs-miR-155-5p-Nfe2l2轴的治疗策略潜力。
动物
从SLAC实验动物有限公司（中国上海）购买了10-12周龄的雄性C57BL/6小鼠。小鼠被饲养在无特定病原体的环境中，温度（23-24°C）、湿度（55±5%）和光照（12小时光照-12小时黑暗）保持恒定。所有小鼠均可自由摄取食物和水。
心肌IR模型的建立和分组
使用计算机生成的随机数对小鼠进行分组。心肌IR模型的建立方法如前所述[18]。简要来说，通过腹腔注射1.5%戊巴比妥...
IR-EVs在心脏IR损伤过程中增强了心脏铁死亡
我们最近的研究表明，给予IR-EVs会显著加重小鼠心脏IR模型中的心脏炎症和功能障碍[13]。为了验证IR-EVs在体内对心脏铁死亡的作用，我们分离了IR-EVs并通过TEM、NTA和Western blot分别确定了它们的特征（见补充图1A-C）。首先，生物发光成像证实IR-EVs在心脏内注射DiR标记的IR-EVs后24小时内仍能留在心脏内（见补充图...
讨论
冠状动脉阻塞后恢复心脏血流是主要的治疗策略，但再灌注后的继发性心肌细胞死亡和心脏功能下降仍然难以解决。保护不可再生的心肌细胞免受损伤/死亡对于在缺血损伤期间维持心脏功能至关重要[24]。最近的研究证实了RCDs在IR后心肌细胞丢失中的作用[1]。已知的RCDs（如半胱天冬酶依赖性凋亡）已被研究作为...
结论
总结来说（见图7），本研究揭示了心脏IR损伤中一种新的基于EV的铁死亡调控机制。IR-EVs能够将miR-155-5p传递到心肌细胞中，并通过抑制Nfe2l2的抗氧化通路促进IR诱导的铁死亡。因此，通过靶向IR-EVs/miR-155-5p来抑制铁死亡可能有助于实现理想的治疗效果。
资助
本研究得到了上海市科学技术委员会（STCSM；项目编号23ZR1452500）、国家自然科学基金（NSFC；项目编号81670458和82100350）以及上海浦东新区卫生健康委员会重点学科建设项目（项目编号PWZxk-2022-20）的支持。
机构审查委员会声明
所有实验程序均获得了同济大学机构动物护理和使用委员会的批准（编号：TJLAC-019-148）。
CRediT作者贡献声明
Xinyu Ge：撰写 – 原稿撰写、方法学设计、实验实施、资金筹集、数据分析。Qingshu Meng：方法学设计、实验实施、数据分析。Jing Liu：方法学设计、实验实施。Enhao Wang：结果验证、方法学设计。Xuan Liu：方法学设计、实验实施。Shanshan Shi：方法学设计、实验实施。Xin Gong：资源协调、数据分析。Zhongmin Liu：项目管理。Wei Han：资金筹集、数据分析。Xiaohui Zhou：撰写 – 文稿审阅。
