菌丝层是指与真菌菌丝相关联的细菌群落,这是一个高度特殊化的环境,其中细菌多样性受到真菌的显著影响(
1)。
Paraburkholderia DD10菌株是一种革兰氏阴性、杆状、可移动的细菌,从丛枝菌根真菌
Rhizophagus irregularis的根外菌丝层中分离得到。该菌株是研究细菌-菌根真菌相互作用机制的宝贵工具。
该细菌是通过捕捉实验分离得到的。在播种时,将
R. irregularis DAOM197198菌株的1,000个孢子接种到亚麻植物(
Linum usitatissimum,Erodor品种)中。培养在双室系统中进行,只有真菌菌丝能够通过10 μm的网孔进入第二个室。两个室中都添加了细粒和粗粒沸石作为基质。植物用0.5× Long Ashton溶液进行灌溉(
2),而第二个室则添加了植酸(0.3 mmol)和硝酸盐(2.5 mmol)。从一块草地土壤(坐标42°31′49.3″ N, 2°59′06.3″ E)中提取的渗滤液被引入真菌室。8周后,根据Zhang等人的方法(
3)分离出在真菌菌丝上生长的细菌。将菌丝层细菌悬浮液用10%胰蛋白酶大豆肉汤洗涤并连续稀释,以便在每个平板上获得单个细菌菌落。通过简单的实验测试(
4),在24°C下检测细菌降解植酸的能力,并在24°C的暗室中观察其在
R. irregularis菌丝上的生长情况(持续2–3周)。在双室
体外系统中评估其生长情况,即在第二个室中接种OD 0.1稀释度的细菌培养物。DD10菌株同时具备这两种特性,并能利用菌丝在异质土壤中获取磷(
5)。从在28°C下振荡培养72小时的Luria-Bertani液体培养物中分离出DD10的DNA。将细胞悬浮液离心后,使用Macherey-Nagel公司的NucleoBond试剂盒(包括Set III和AGX100柱)纯化DNA。按照Oxford Nanopore Technologies公司的Rapid Barcoding Kit 96 V14试剂盒说明书制备测序文库(未进行剪切或大小筛选)。测序使用Oxford Nanopore MinION仪器和R10.4流动池完成,数据采集由MinKNOW软件实现。碱基调用和读取质量控制(包括错误校正和接头修剪)使用Dorado 0.6.1软件在计算集群(Bioinfo Genotoul,图卢兹奥克西塔尼)上完成。测序得到的平均读长(
N50)为7.7 kb,共获得136,564条原始读段。使用长读长组装工具Flye 2.9.2(
6)进行
de novo组装。基因组未进行旋转处理。注释工作使用NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline(PGAP)6.10(
7)完成。
最终得到3个contig,分别对应一条4 Mbp的环状DNA链、一条3.4 Mbp的染色质和一条212 kbp的质粒。基因组的特征在
表1中展示。最接近的的分类单元是
Paraburkholderia terricola(分类ID 169427:
SAMN05192548),相似度为97%,鉴定使用TYGS软件(
9)。共预测出6,941个基因,使用Operon mapper v.1软件确定操作子的数量(
10)。使用BUSCO 5.8.3(
11)分析基因组的完整性,结果显示其与
Burkholderiales组的688个基因具有100%的一致性,其中有两个基因存在重复拷贝。所有软件均使用默认参数,除非另有说明。