《Biological Control》：Discovery of novel non-live bacterial bioinsecticides for mosquito control through a high-throughput screening pipeline
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为应对化学杀虫剂抗性及生态危害的挑战，本研究通过系统性高通量筛选，从波多黎各环境样本中鉴定出30株具有强效杀蚊幼虫活性的非活细菌，其中3株可在24小时内导致100%死亡率。这些经热灭活的菌体生物质对多种蚊媒幼虫均表现出剂量依赖性广谱活性，且以颗粒形式投递可增强效果。研究建立了一套高效发现环境友好型微生物源非活生物杀虫剂的流程，为蚊媒综合管理提供了新工具。
蚊子，这个小小的昆虫，却是全球公共卫生的巨大威胁。它们传播登革热、寨卡、基孔肯雅热等病毒性疾病，以及疟疾、淋巴丝虫病等寄生虫病，每年导致数十万人死亡。随着城市化进程和气候变化，蚊媒疾病的分布范围正在扩大，传统上局限于南亚的疟疾媒介——斯氏按蚊（Anopheles stephensi）现已入侵非洲城市，而埃及伊蚊（Aedes aegypti）和致倦库蚊（Culex quinquefasciatus）等也因其强大的环境适应力，持续构成挑战。目前，控制这些疾病的主要手段是中断蚊虫的传播链，但长期依赖化学杀虫剂带来了严峻问题：蚊虫抗药性快速进化、杀虫剂对非靶标生物和生态系统造成危害，以及潜在的人类健康风险。这使得开发新型、可持续且环境友好的蚊媒控制策略变得尤为迫切。
在众多替代方案中，针对蚊虫水生幼虫阶段的杀幼虫剂（larvicides）因其作用目标明确、对环境冲击较小而备受关注。然而，现有的合成杀幼虫剂如双硫磷（temephos）和吡丙醚（pyriproxyfen）也存在毒性、抗性和应用局限性。因此，微生物源杀幼虫剂，例如已广泛使用的苏云金芽孢杆菌以色列亚种（Bacillus thuringiensis israelensis, Bti）和球形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sphaericus），成为了有前景的替代品。近年来，非活体（non-live）微生物制剂，如巴拿马色素杆菌（Chromobacterium sp. Panama, C.sp_P），因其活性物质稳定、安全性高且无需活菌感染而显示出独特优势。这启示我们，大自然丰富的微生物宝库中，可能蕴藏着更多能产生热稳定杀虫活性物质（通过分子而非感染起作用）的细菌资源。为了高效地从海量环境微生物中挖掘这些“宝藏”，建立一套高通量、标准化的筛选流程至关重要。
为了应对上述挑战，由Madhavinadha Prasad Kona、Vandana Vandana、George Dimopoulos等人组成的研究团队开展了一项系统性研究，旨在通过建立一套高通量筛选（High-Throughput Screening, HTS）流程，从多样化的环境样本中发现具有强效杀蚊幼虫活性的新型非活细菌菌株，并评估其作为环境友好型生物杀虫剂的潜力。这项研究发表在国际期刊《Biological Control》上。
研究人员为开展此项研究，运用了几个关键的技术方法：首先，从波多黎各东南沿海的热带环境中系统性地采集了48份环境样本（包括土壤、树皮、干树叶、根际土壤等）。其次，建立了一套涵盖细菌分离、非活生物质制备和高通量幼虫生物测定的完整实验流程。具体而言，样本经处理后，通过平板划线分离获得486株细菌单克隆；这些菌株经有氧和厌氧培养后，进行热灭活（70°C，2-3小时）和干燥处理，最终将菌体生物质嵌入含有鱼食上清液的琼脂糖中制成颗粒。然后，在24孔板中使用二龄埃及伊蚊（Aedes aegypti）幼虫对所有这些菌株的琼脂糖颗粒进行初筛。此外，利用16S rRNA（核糖体RNA）基因测序对活性菌株进行属水平的分类学鉴定，并构建系统发育树分析其进化关系。最后，对初筛中表现优异的菌株进行大规模培养，制备成不同浓度（200 mg/mL和400 mg/mL）的非活细菌-琼脂糖颗粒，并进一步测试其对三种重要蚊媒——埃及伊蚊、致倦库蚊和斯氏按蚊的杀幼虫活性，以评估其广谱效应和剂量依赖性。
3.1. 高通量筛选和幼虫生物测定
研究人员从48份环境样本中总共获得了486株细菌分离株。通过高通量筛选，发现其中30株菌株对埃及伊蚊幼虫表现出显著的杀幼虫活性（24-96小时内造成80-100%死亡率）。尤为突出的是，有三株菌——28.08（假单胞菌属 Pseudomonas）、28.04（泛菌属 Pantoea）和29.01（假单胞菌属 Pseudomonas），在暴露后24小时内就实现了100%的幼虫死亡率。这些活性菌株主要来源于干树叶、根际土壤、普通土壤、根茎和花蕾等环境。研究使用灭活的大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）琼脂糖颗粒作为阴性对照（无致死性），而以巴拿马色素杆菌（C.sp_P）颗粒作为阳性对照（100%致死）。
3.2. 细菌分离株的鉴定
通过对这30株高活性菌株进行16S rRNA基因序列分析，研究人员确定了它们的属级分类。结果显示这些菌株分属于9个不同的属，包括肠杆菌属（Enterobacter，7株）、芽孢杆菌属（Bacillus，6株）、沙雷氏菌属（Serratia，5株）、不动杆菌属（Acinetobacter，4株）、假单胞菌属（Pseudomonas，2株）、色素杆菌属（Chromobacterium，2株）、泛菌属（Pantoea，2株）、葡萄球菌属（Staphylococcus，2株）和拉乌尔菌属（Raoultella，1株）。系统发育树分析进一步确认了这些分类关系。
3.3. 选定菌株的扩大培养
为了进一步验证活性，研究人员根据系统发育多样性和杀幼虫效力，从30株菌中挑选了15株进行大规模培养，以生产足量的非活菌体生物质。
3.4. 扩大培养菌株的幼虫生物测定
对这15株菌制备的两种浓度（200 mg/mL和400 mg/mL）的非活细菌-琼脂糖颗粒进行测试。在较高浓度（400 mg/mL）下，大部分菌株对三种蚊媒幼虫都表现出高效的广谱杀幼虫活性（80-100%死亡率）。其中，菌株28.08（假单胞菌属）在400 mg/mL浓度下对所有三种蚊子都有效，甚至在200 mg/mL浓度下对埃及伊蚊仍保持高效。研究还观察到了明显的剂量依赖性和蚊种间敏感性差异：斯氏按蚊幼虫普遍最为敏感，而埃及伊蚊幼虫在较低浓度下对多数菌株表现出更强的耐受性。此外，一项有趣的对比实验发现，对于某些菌株（如沙雷氏菌37.12），将菌体生物质制成琼脂糖颗粒投递比直接将粉末悬浮于水中能产生更强的杀幼虫效果，这可能是因为颗粒形式有助于活性代谢物的局部浓缩和延长接触时间。
在讨论部分，作者深入阐述了本研究的发现和意义。研究成功建立的高通量筛选平台，能够高效地从大量环境菌株中鉴定出依赖于热稳定毒素或代谢物（而非活菌感染）起作用的杀幼虫菌株。这一聚焦点使得发现的候选菌株具有实际应用优势：非活菌体制剂在稳定性、安全性和部署便利性上优于活的生物防治剂，可能具有更长的保质期，更容易存储和运输，并且可能简化监管审批流程。
研究发现的活性菌株具有丰富的生物多样性，且许多来源于根际土壤和腐烂植物材料等生态位，这提示这些微环境可能是发现具有昆虫拮抗活性微生物的“热点区域”。这些菌株中包含了已知的昆虫病原菌属（如芽孢杆菌属和色素杆菌属），也包含了像假单胞菌属、沙雷氏菌属和肠杆菌属等具有广泛代谢潜力但杀蚊活性尚未被充分探索的菌属。活性在热灭活后得以保留，强有力地表明其作用机制源于稳定的次级代谢产物或毒素。
此外，研究对比了不同的制剂形式，发现琼脂糖颗粒作为一种递送基质，可能通过促进幼虫摄食或延缓活性成分释放，来增强某些菌株（尤其是沙雷氏菌）的效力。这为未来开发具有成本效益和实用性的剂型提供了思路。
当然，研究也指出了未来的方向：需要进一步鉴定这些菌株产生的具体活性化合物（生物活性代谢物），阐明其作用机制（作用模式），并通过基因组学分析寻找相关的生物合成基因簇。同时，必须进行针对非靶标生物的毒理学评估，以确保环境安全性。最终，还需要通过半田间和田间试验，在真实环境条件下验证这些候选生物杀虫剂的效能和稳定性。
结论部分对全文进行了总结。本研究成功构建了一条高效的高通量筛选流程，用于发现对主要蚊媒具有强效、广谱杀幼虫活性的新型细菌菌株，且其活性由非生物因素（热稳定分子）介导。通过探索多样化的生态环境，特别是根际相关土壤和腐烂植物材料，鉴定出了多个能产生热稳定杀虫化合物的候选菌株。非活菌体制剂在稳定性、易于处理和适用不同田间条件方面的优势，进一步强化了其实际应用价值。这些发现凸显了微生物多样性作为环境可持续、可扩展蚊媒控制剂来源的巨大潜力，为应对日益严重的杀虫剂抗性问题提供了新的工具，有助于推动蚊媒综合管理（Integrated Vector Management, IVM）策略的发展。
