广泛使用的聚集性梭杆菌菌株PK1594的完整基因组序列

基因组测序显示PK1594菌株属于Fusobacterium hwasookii而非F. nucleatum，其染色体2,357,192 bp，含20,441 bp的环状质粒，通过Illumina和 Nanopore测序完成组装。

　　

摘要

我们报告了Fusobacterium菌株PK1594的完整基因组序列，该菌株被广泛用于研究Fusobacterium nucleatum与口腔细菌之间的聚集现象。基因组由一条2,357,192 bp的染色体和一个20,441 bp的contig组成，后者代表一个重复的10,221 bp的质粒。znpA基因分析表明，PK1594属于Fusobacterium hwasookii而非Fusobacterium nucleatum。

公告

Fusobacterium nucleatum是一种革兰氏阴性细菌，与多种口腔疾病和全身性感染有关（1, 2）。这种细菌的一个显著特征是能够与多种口腔细菌聚集（2）。在早期研究Fusobacterium nucleatum介导的聚集机制时，常用的菌株有ATCC 25586和PK1594（3, 4）。Fusobacterium nucleatum是一个高度多样化的菌群，目前分为四个亚种：nucleatum（FNN）、vincentii（FNV）、polymorphum（FNP）和animalis（FNA）。根据遗传学、基因组学和生化证据，ATCC 25586被归类为FNN亚种（5, 6）。然而，直到现在，PK1594菌株的基因序列和分类信息一直缺乏。

PK1594菌株最初从人类牙龈下部位分离得到，并于1982年首次被报道为Fusobacterium nucleatum菌株VPI E2S-11A（7）。1989年，该菌株在已故的Paul E. Kolenbrander博士（NIDCR, NIH）的实验室中被重新命名为PK1594（4）。通过将菌株从-80°C的甘油保存液中复苏，直接接种到含有1%蛋白胨的胰蛋白酶大豆肉汤中，并在37°C下厌氧培养14小时后，成功恢复了该菌株。细胞通过离心分离，基因组DNA使用ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit（Zymo Research, D4300）按照制造商的协议提取。DNA浓度使用Qubit 4荧光计（Thermo Fisher Scientific, Q33327）测定。测序工作由SeqCenter（宾夕法尼亚州匹兹堡）使用Illumina和Oxford Nanopore Technologies（ONT）平台完成。

Illumina文库的制备使用了Illumina DNA Prep试剂盒，该试剂盒在标记过程中会对基因组DNA进行酶切处理。文库经过基于珠子的大小筛选，目标平均插入片段长度约为280 bp。双端（2 × 151 bp）测序在NovaSeq X Plus系统上进行。除非另有说明，所有分析均使用默认参数。经过接头修剪和质量过滤后，Illumina测序得到的数据量为6,888,276对读段（总长度983 Mbp），其中N50值为151 bp，质量大于Q30（覆盖度约为50倍）。ONT文库的制备使用了无PCR的Ligation Sequencing Kit（SQK-NBD114.96）和NEBNext Companion Module（E7180L），随后在GridION平台上使用R10.4.1流动细胞仪进行测序（400-bp模式）。碱基调用使用Dorado v0.5.3（超高精度模型）完成，FASTQ文件使用samtools fastq v1.20工具提取（8）。ONT测序产生了308,792条读段，总长度约为562 Mbp（N50 = 3,872 bp）。接头序列使用Porechop工具去除。Illumina和ONT读段的de novo混合组装使用Flye v2.9（nano-hq模型）完成（9）。组装质量使用QUAST v5.0.2进行评估（10），结果显示总组装长度为2,377,633 bp，包含两个contig，其中一个contig的长度为2,357,192 bp，GC含量为27.13%。使用Circlator v1.5.5验证了文库的环状结构（11），并通过NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline（PGAP）v5.2完成了注释（12）。最终得到两个环状contig：一条2,357,192 bp的染色体和一个包含完美串联重复序列的20,441 bp质粒contig，表明其实际环状长度约为10,221 bp。

znpA基因的分析表明，PK1594菌株属于Fusobacterium hwasookii，这一物种与Fusobacterium nucleatum关系密切（13）（图1）。该菌株的基因组编码了fap2、fadA和fomA的同源基因，但缺乏radD基因。PK1594的完整基因组序列为未来研究其生理特性、毒力因子和宿主相互作用提供了基础。

图1

图1 PK1594菌株的znpA基因的系统发育分析。该系统发育树基于Fusobacterium nucleatum、Fusobacterium hwasookii（FH）和Fusobacterium periodonticum（FP）的典型菌株及临床分离株的完整znpA基因序列（1,227 bp）构建。使用MEGA-X软件的UPGMA方法和最大复合似然模型（Maximum Composite Likelihood）以及100次bootstrap重复进行构建；分支节点处显示了bootstrap值。PK1594的znpA基因属于Fusobacterium hwasookii分支。

致谢

本研究得到了NIDCR项目DE030895和DE034542的支持（资助对象为C.W.）。

我们感谢Robert J. Palmer博士（NIDCR, NIH）慷慨提供PK1594菌株。