从墨西哥恰帕斯州的Theobroma cacao中分离出的Burkholderia semiarida的基因组序列草图

墨西哥恰帕斯州可可种植土壤中分离出半干旱假单胞菌CLM7-1株，完成基因组测序（7,351,596 bp，278条contig），系统发育分析显示与巴西洋葱腐败相关种亲缘关系最近。基因组特征揭示其具有 ornibactin 系统铁载体（100%）、pyrrolnitrin 苯并吡咯酮类杀菌素（100%）及 aminopolycarboxylic acid 金属载体（44%）等基因，可能参与生物调控及中金属吸收，且对可可无致病性。

　　

摘要

在墨西哥农业土壤中对Burkholderia属物种进行研究时，从墨西哥恰帕斯州生长的Theobroma cacao L.的根际中分离出了Burkholderia semiarida。本文介绍了Burkholderia semiarida CLM7-1的基因组草图。

公告

通过对墨西哥Burkholderia pseudomallei的研究，在农田周围采集了多个土壤样本。CLM7-1菌株是从墨西哥恰帕斯州（坐标：14°58′59.0″ N 92°09′10.0″ W）种植的可可树根际中分离出来的。将5克可可根际样本重新悬浮在5毫升无菌水中，然后取50微升样本涂布在Ashdown培养基（1）上，并在37°C下培养72小时。由于B. pseudomallei具有多种菌落形态（2），因此选择了不同的菌落进行进一步研究。最终选出了CLM7-1菌株，并将其保存在-70°C的35%甘油中。该菌株在5毫升BSE培养基中培养以获取用于分子鉴定和基因组测序的DNA，随后使用CTAB协议（3）进行DNA纯化。鉴定过程采用通用引物27F（5′-GTGCTGCAGAGACTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-CACGGATCCTADGGGTACCTTACGACT-3′）（4），通过Taq DNA聚合酶（New England Biolabs）扩增16S rRNA基因。基因组测序工作由Macrogen INC公司使用SANGER技术完成（https://www.macrogen.com/）。16S rRNA基因序列（PQ463740）确认该菌株属于Burkholderia cepacia复合群（Bcc）。基因组测序由Novogene公司（https://www.novogene.com/us-en/）使用Illumina NovaSeq 6000平台（150-bp双端测序；平均读长）进行，试剂盒为NEBNext Ultra DNA library prep kit，插入片段长度为350 bp。除特别说明外，所有分析均采用默认参数。原始双端测序数据使用Trimmomatic v0.39（5）去除低质量序列（Phred值低于15）和Illumina接头；质量评估通过fastqc v0.12.1（6）完成。De novo组装使用MaSuRCA v4.0.8（7）进行。注释工作依据NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline（PGAP）v5.1的标准操作流程完成。基因组总长度为7,351,596 bp，包含278个contig，N50值为134,978 bp，基因组覆盖率为90×，完整性为99.77%，污染率为0.94%。G + C含量为67.18%，基因总数为6,838个，其中蛋白质编码基因6,680个，RNA基因52个，tRNA 45个，完整的RNA包括1个5S、1个16S和1个23S。比较基因组学分析显示，该菌株与B. semiarida CBAS 905^T在平均核苷酸同一性（OrthoANIu）方面有98.5%的相似性（8），在数字DNA杂交（Genome-to-Genome Distance Calculator 3.0）方面有87.4%的相似性（9）。系统发育分析表明CLM7-1菌株与B. semiarida CBAS 905^T属于同一分支（图1）。这是墨西哥首次分离出B. semiarida菌株，该菌株在巴西曾被报道可导致洋葱表皮变酸（10），在中国也曾导致一名免疫功能正常患者反复出现肺部感染（11）。然而，该菌株似乎不会对可可树造成损害，因为在采样时植株外观健康。通过antiSMASH 7.0网站（12）的基因组分析发现，该菌株含有编码铁载体ornibactin（100%）、杀菌剂pyrrolnitrin（100%）和金属载体aminopolycarboxylic acid（44%）的基因，这些成分可能在可可根际中发挥生物控制和金属吸收的作用。

图1

图1 Burkholderia属物种及Burkholderia semiarida菌株的系统发育树。研究使用了PhyloPhlAn v 3.0选定的400个保守的通用蛋白质标记（13），通过最大似然法构建了深度分支的系统发育树。氨基酸替换模型（LG）和自助法分析（1,000次重复）由IQ-TREE软件（14）完成。条形图表示序列之间的差异数量，其中B. semiarida CLM7-1菌株用粗体标出。该树图使用MEGA 10软件生成。

致谢

本研究由墨西哥科学、人文、技术和创新部（SECIHTI）资助，项目编号为CF-I-2023-1332。N.-P.O.-C.、L.-M.M.-R.和J.-C.K.-D.感谢SECIHTI提供的奖学金。V.L.-S.和P.E.-D.L.S.感谢SNI-SECIHTI、EDI和COFAA的支持。