基于金/垂直石墨烯的双通道电化学免疫传感器，用于血液中破伤风毒素的即时检测

《Biosensors and Bioelectronics》：Gold/vertical-graphene-based dual-channel electrochemical immunosensor for point-of-care testing of tetanus toxin in blood

基于金纳米颗粒/垂直石墨烯双通道电化学免疫传感器，成功实现破伤风毒素（0.024 fg mL?1）高灵敏检测与临床全血/血清样本快速定量分析。该系统整合37℃恒温模块与自主研发软件，10-25分钟完成POCT场景下毒素浓度（0.1-100 ng mL?1）精准测量，显著提升诊断效率并降低漏诊风险。

　　

Bing Zhang|Hongji Li|Wei Li|Xiuwei Xuan|Cheng Liu|Cuiping Li|Hongzhi Li|Mingji Li

天津工业大学化学与化学工程学院有机太阳能电池与光化学转化重点实验室，中国天津市300384

摘要

破伤风痉挛毒素已被确定为导致破伤风的主要致病物质，对其的微量检测有望提供可靠的诊断生物标志物。在这项研究中，我们开发了首个能够实现快速现场检测和实时分析的电化学破伤风毒素免疫传感器。该电化学传感器结合了相互验证的双通道（氧化通道和还原通道）策略以及具有高抗体负载能力的金纳米颗粒嵌入垂直石墨烯（Au–VG）微电极，从而实现了卓越的检测可靠性和性能稳定性。通过整合免疫反应、探针的氧化还原反应以及自主研发的实时分析软件，使得基于电流响应能够特异性地检测破伤风毒素。该传感器具有宽线性检测范围（0.1 fg mL^?1至100 ng mL^?1），氧化通道和还原通道的检测限分别为0.024 fg mL^?1和0.021 fg mL^?1。此外，包含柔性Au-VG微电极的针式传感器和测试盒系统已成功用于临床血清和全血样本中破伤风毒素的定量检测。本研究开发了一种新型免疫传感器和快速现场检测策略，在破伤风的早期筛查和诊断中具有显著的应用潜力。

引言

破伤风是一种由产毒梭菌（Clostridium tetani）引起的危及生命的神经系统疾病（Liang等人，2025年；Saeedi和Nejad，2025年）。破伤风毒素是一种高效的外毒素，通过阻断抑制性神经递质甘氨酸和γ-氨基丁酸的释放来引发破伤风（Eskikand等人，2025年；Meglic等人，2025年）。破伤风的临床症状包括肌肉僵硬、痉挛、痉挛性麻痹、呼吸衰竭和自主神经功能障碍。目前尚无商业化的破伤风检测方法，诊断仍依赖于多种临床症状的组合。破伤风的高死亡率归因于缺乏早期诊断方法，这常常导致治疗延误（Zhuang等人，2021年）。

目前，酶联免疫吸附测定（ELISA）、荧光免疫测定和放射免疫测定用于检测血液中的破伤风毒素抗体（Herr等人，2005年；Modh等人，2016年；Raeisi等人，2018年）；这些方法可以确定个体是否感染了破伤风或对破伤风疫苗产生了免疫反应。然而，由于感染者健康状况的差异，抗体（Ab）水平不能作为破伤风的诊断标志物。理想的诊断测试应直接检测抗原（Ag）而非抗体。不幸的是，由于现有临床方法的灵敏度不足，关于破伤风抗原检测方法的研究很少。Chen等人报道了一种荧光可视化破伤风毒素检测方法，检测限为0.25 fg mL^?1，并建议将破伤风感染的临界值设定为5 fg mL^?1；然而，至今尚未有后续的临床应用报道（Chen等人，2022年）。因此，开发一种快速、灵敏且准确的破伤风抗原检测方法，以便在低成本下用于即时检测（POCT）场景，是一个紧迫的目标。电化学（EC）POCT平台具有灵敏度、快速性、便携性、易用性和成本效益，适用于资源有限地区的现场检测（Kim等人，2024年；Mao和Ding，2026年）。

亲和配体，如抗体、核酸适配体和肽，可以特异性地识别破伤风毒素（Saeedi和Nejad，2025年；Seatovic等人，2004年）。Ag和Ab之间的免疫反应最为特异，且破伤风毒素的抗体已经实现了工业化生产（Liang等人，2025年）。此外，金纳米颗粒（NPs）因其独特的性质（包括低毒性、化学稳定性、高电催化活性和纳米酶效应）而受到广泛关注（Rabbani等人，2024年；Wang等人，2020年）。这些性质使Au NPs能够作为抗体载体和电化学免疫传感器中的电催化活性位点，用于体内和体外蛋白质检测（Li等人，2025年；Yang等人，2023年）。另一方面，石墨烯及其衍生物作为二维纳米材料，具有较大的比表面积，具备优异的电学和电化学性能，被广泛用作金属纳米颗粒和蛋白质载体，以及信号放大平台（Wang等人，2024年；Yang等人，2024年）。特别是垂直石墨烯（VG）平台，由于其独特的三维（3D）结构，通过扩大层间间隙、形成短程电子通道和建立长程3D离子扩散路径，显著增强了载流子传输和电催化活性（Gao等人，2025年；Liu等人，2022年）。

在此，我们报道了一种灵敏的POCT双通道EC传感器的开发，该传感器通过整合破伤风毒素抗体、氧化还原探针、Au NP嵌入的VG（Au–VG）信号放大平台和便携式37°C恒温器来直接检测破伤风类毒素。我们首次证明了Au-VG纳米片能够有效固定破伤风抗体（图1a），并在特异性结合破伤风类毒素后导致氧化还原双通道中的探针电流变化（图1b）。组装了基于Au-VG微电极的测试盒和针式传感器，能够测定临床血液中的破伤风毒素浓度（图1c）。早期微量检测破伤风毒素并建立金标准阈值对于避免漏诊、缩短病程、减少长期残疾和降低死亡率具有重要意义（图1d）。

本研究的新颖性和重要性总结如下：首先，通过稳定的化学气相沉积（CVD）和成熟的电沉积工艺制备了Au-VG微电极（100 μm × 700 μm），作为破伤风毒素检测的稳健EC信号放大平台。据我们所知，这是首个专为破伤风毒素设计的EC免疫传感器，其双通道架构提高了检测可靠性，并实现了10–25分钟内的快速分析。此外，建立了一个完全集成的便携式EC免疫测定系统——包括免疫传感器、37°C恒温模块和定制分析软件——用于直接分析临床血液样本。最后，开发了一种针状Au-VG传感器设计策略，实现了人血液中破伤风毒素的实时原位定量，显示出直接血液检测的巨大可行性。总体而言，这一EC-POCT系统接近应用准备阶段，对破伤风的早期诊断以及其他毒素的筛查具有巨大潜力。

实验部分

实验材料、表征方法、Au-VG微电极和免疫传感器的制备、EC测试盒的组装以及细胞实验详见支持信息。

Au-VG微电极的表征

通过化学气相沉积制备了一组柔性VG微电极。石墨烯纳米片的厚度和VG薄膜层的高度由生长时间决定。9–20分钟的生长时间产生了表面覆盖大量垂直生长、薄而透明纳米片的样品（图2a和S4）。生长12分钟的VG样品显示出约10微米厚的VG层，每个层由……组成

结论

开发了一种简单、灵敏且便携的电化学免疫测定方法，用于检测血液中的破伤风类毒素（TT）。双通道EC传感器系统通过将抗体（Ab）吸附到Au-VG微电极上、Ab与TT之间的免疫反应以及探针在Au-VG传感器上的氧化还原反应来构建。该系统基于电流变化直接量化TT浓度。该传感器能够检测0.1 fg mL^?1至100 ng mL^?1浓度范围内的TT，检测限低

CRediT作者贡献声明

Hongji Li：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、研究、概念构思。Xiuwei Xuan：可视化、监督、软件。Wei Li：研究、数据管理。Cheng Liu：验证、资金获取、正式分析。Cuiping Li：可视化、监督、研究。Mingji Li：撰写 – 原稿撰写、验证、方法学、资金获取、概念构思。Hongzhi Li：资金获取、正式分析。Bing Zhang：撰写 – 原稿

未引用的参考文献

Sevcik, 1948.

利益冲突声明

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致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号52271341和62271350）和国家高水平医院临床研究资助（北京大学第一医院青年临床研究项目）（编号2025YC22）的财政支持。