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本文利用高速原子力显微镜（HS-AFM），首次在单纤维水平实时观测了工业真菌米曲霉（Aspergillus oryzae）疏水蛋白RolA形成杆状体（rodlet）及致密薄膜的动态过程，揭示了此前未知的“表面催化延伸”（surface-catalyzed elongation）机制。研究发现，杆状体两端以“生长”与“暂停”状态交替的方式不连续延伸，且其成束能显著降低两端状态转换及延伸（dock–lock模型）的能量势垒，使延伸速率倍增。这种由相邻杆状体侧面相互作用催化的机制，促进了杆状体的有序排列和定向域结构形成，为理解真菌细胞表面形成疏水性保护涂层的分子机理提供了关键概念性进展。
文章内容归纳总结
摘要
疏水蛋白（Hydrophobins）是丝状真菌中保守的功能性淀粉样蛋白，其纤维化形式称为杆状体，可作为保护性涂层。杆状体进一步组装形成致密薄膜，有助于菌丝体表面的疏水性。然而，这种致密薄膜的形成机制尚不完全清楚。本研究使用高速原子力显微镜直接观察了米曲霉疏水蛋白RolA在单纤维水平上杆状体成束及后续薄膜形成的结构动力学，从而揭示了薄膜形成机制。研究发现杆状体两端均可延伸，且过程不连续，在能够延伸的生长状态和不能延伸的暂停状态之间交替，这表明杆状体末端存在两种不同结构状态的平衡。此外，研究还发现了一种称为“表面催化延伸”的途径，即杆状体之间的侧面相互作用促进了延伸。表面催化延伸降低了杆状体末端在生长与暂停状态之间转换以及延伸的能量势垒，使成束杆状体的延伸速率加倍。杆状体表面可被视为邻近杆状体延伸的催化剂。这种机制有助于杆状体成束并倾向于形成定向的域结构，蒙特卡洛模拟证实了这一点。本研究提出的概念清晰地解释了杆状体在细胞表面形成致密涂层的机制。
引言
组装成交叉β折叠纤维的淀粉样蛋白可以捆绑形成更大的聚集体。尽管淀粉样纤维常与蛋白质错误折叠和神经退行性疾病相关，但它们也被细菌、真菌、昆虫和哺乳动物有益地用作功能性淀粉样蛋白以维持生理过程。疏水蛋白是丝状真菌产生的功能性淀粉样蛋白；它们形成称为杆状体的淀粉样纤维，这些杆状体有序排列形成致密薄膜，支持真菌生理功能。疏水蛋白是低分子量两亲性蛋白质，可粘附在细胞壁表面形成涂层并使其疏水。这种表面修饰有助于促进分生孢子的空气分散性，并帮助菌丝粘附于疏水表面。疏水蛋白还具有免疫沉默特性，因为病原性丝状真菌菌丝的疏水蛋白涂层可防止被宿主免疫系统识别。一些疏水蛋白可能参与固体聚合物的降解。
疏水蛋白根据其氨基酸序列和表面疏水性分为几类。I类疏水蛋白可自组装成杆状体。疏水蛋白通常包含三个形成交叉β折叠结构的疏水环，这些结构在分生孢子表面组装成成束的有序杆状体。在我们之前的研究中，从工业真菌米曲霉中纯化的I类疏水蛋白RolA在空气-水界面形成致密的杆状体薄膜；这些薄膜被转移到基底上，显著改变了基底的润湿性。因此，杆状体是影响固体表面特性的关键因素，并可能调节真菌细胞壁的生物学功能，尽管其形成机制在很大程度上仍属未知。理解疏水蛋白从单体转变为杆状体，然后密集组装成排列整齐的薄膜的动态过程，是揭示疏水蛋白多种功能的关键。
杆状体形成被认为类似于通常的淀粉样纤维形成：由成核启动，随后单体以预形成的杆状体为模板结合到杆状体末端，进行自催化生长。先前使用硫磺素T（ThT）测定法和时间分辨率较低的原子力显微镜的研究提供了对杆状体薄膜形成的宏观见解，但未能揭示详细机制。全面理解杆状体薄膜形成不仅需要阐明单个杆状体的形成，还需要阐明它们之间的相互作用和组装。这需要在单纤维水平上进行高时空分辨率的实时观察以及对局部相互作用的定量分析。
在本研究中，我们使用高速原子力显微镜观察米曲霉疏水蛋白RolA杆状体的形成，并在单纤维水平上直接测量杆状体形成的动力学。高速原子力显微镜显示，它们具有从两端快速且不连续延伸的显著能力。延伸的动力学取决于邻近杆状体的存在，在邻近区域延伸会加速。杆状体的侧面相互作用导致它们成束，我们的蒙特卡洛模拟表明，高速原子力显微镜检测到的这种局部反应有助于致密杆状体薄膜的集体有序排列。这些发现为理解杆状体薄膜形成的原理提供了机制性见解。
结果
溶液中杆状体的形成
为了研究与杆状体形成相关的RolA结构变化，我们使用了圆二色光谱。单体RolA的CD光谱在约205 nm处有最小值。在杆状体形成后，最小值转移到约220 nm，表明与单体状态相比β折叠含量增加。这些结果支持了RolA通过建立分子间β折叠结构进行杆状体形成的假设。
为了进一步阐明杆状体形成的机制，我们进行了ThT荧光测定。反应曲线没有显示出淀粉样蛋白聚集通常观察到的特征性S形。相反，观察到荧光强度在没有滞后期的情况下立即增加，然后以恒定速率增加直至达到饱和。使用公式1进行数据拟合提供了良好的拟合。模型拟合表明，杆状体形成可以通过停靠-锁定模型很好地描述，并且不存在杆状体复制系统，例如二级成核，正如之前对其他I类疏水蛋白（如稻瘟病菌的MPG1）所报道的那样。由于空气-水界面在疏水蛋白的自组装中起着至关重要的作用，我们检查了其对RolA自组装的影响。在没有空气-水界面的情况下，未观察到ThT荧光增加。然而，在引入空气-水界面后，ThT荧光立即显著增加，表明该界面强烈促进了杆状体形成。在种子测定中，添加10%（体积比）的种子导致在没有空气-水界面的情况下ThT荧光增加。这些结果表明，尽管RolA在没有空气-水界面的情况下不会形成具有聚集能力的物种，但可以发生种子化。然而，这种分析并未提供对杆状体形成机制的进一步见解，凸显了批量溶液测量在阐明该过程细节方面的局限性。
杆状体延伸的高速原子力显微镜分析
为了阐明杆状体延伸机制的细节，我们使用高速原子力显微镜在单纤维水平上进行了检查。首先将少量杆状体固定在疏水性硅基底上，然后在测量期间将基底浸入RolA单体溶液中。我们选择疏水性基底进行分析，因为RolA通过疏水相互作用吸附到固体表面，并可以在疏水-亲水界面形成杆状体。
测量显示，预先存在的杆状体频繁延伸，以及新生成的杆状体的形成和随后的延伸。球状聚集体在杆状体出现之前形成，并作为杆状体前体：其高度逐渐增加并达到2.3 ± 0.1 nm，随后结构转变为杆状形态，继而延伸。还观察到未转化为杆状体的球状结构，高度为3.1 ± 0.4 nm。横截面分析显示，杆状体高度约为3 nm。
预先存在的杆状体最初形成于空气-水界面，而新生成的杆状体则出现在基底上。由于淀粉样纤维的延伸可能因模板表面的结构特性而异，我们比较了预先存在和新生成杆状体的延伸行为。高速原子力显微镜视频分析显示，杆状体在延伸期和长度稳定期之间交替。由连接杆状体延伸起始点和终止点的线性拟合斜率确定的表观延伸速率，对于预先存在的杆状体为7.9 ± 0.9 nm/min，对于新生成的杆状体为11.6 ± 2.4 nm/min，没有统计学上的显著差异。
停滞时间（长度无变化的持续时间）、步长时间（延伸的持续时间）和步长尺寸（每个步长时间的延伸长度）对于预先存在和新生成的杆状体都遵循公式2描述的典型指数分布。平均停滞时间：预先存在杆状体为61.0秒，新生成杆状体为75.6秒；步长时间：29.7秒对比27.3秒；步长尺寸：26.5 nm对比19.2 nm。步速率（单个延伸阶段内的延伸速率，计算为步长尺寸/步长时间）对于预先存在杆状体为9.0 ± 0.3 nm/min，对于新生成杆状体为8.8 ± 0.5 nm/min。这些参数均未观察到统计学上的显著差异。这些结果表明，预先存在和新生成杆状体的延伸行为没有显著差异。
杆状体从两端延伸
RolA杆状体从两端活跃地延伸。首先，我们根据表观延伸速率定义了快端和慢端。一些位于密集区域的杆状体已经有一端与邻近杆状体接触，阻止了进一步延伸；此类杆状体被排除在分析之外。快端的表观延伸速率为12.6 ± 2.6 nm/min，慢端为5.2 ± 1.2 nm/min；差异具有统计学意义。由于各个杆状体之间的延伸速率差异很大，简单地平均快端和慢端的值可能会高估它们之间的差异。因此，我们使用线性混合效应模型进行统计分析，将两端之间的差异视为固定效应，将各个杆状体之间的变异性视为随机效应。我们确认快端和慢端之间的表观延伸速率存在统计学上的显著差异。即使在考虑了杆状体之间的变异性之后，这种差异仍然存在，表明它并非分析过程中引入的假象，而是源于两端的内在差异。
尽管杆状体延伸具有极性，但表观延伸速率的平均相对差异（快端-慢端/快端）仅为约58%。快端和慢端的停滞时间、步长时间和步长尺寸都遵循公式2描述的典型指数分布。快端的平均停滞时间为57.6秒，慢端为95.7秒；步长时间：27.6秒对比25.9秒；步长尺寸：21.7 nm对比18.8 nm；平均步速率：9.2 ± 0.4 nm/min对比8.5 ± 0.5 nm/min。尽管这四个参数没有发现统计学上的显著差异，但快端的停滞时间往往比慢端短。
成束杆状体中延伸的促进
多个杆状体通过侧面相互作用形成束，并且单个杆状体与束内的其他杆状体协调地延伸。没有观察到束解离成单个杆状体。由于杆状体之间的侧面相互作用可能影响其延伸速率，我们测量了成束和单个杆状体的延伸速率；所有延伸的末端都包含在动力学评估中。成束杆状体的表观延伸速率显著高于单个杆状体。
在成束杆状体中，延伸和暂停阶段交替出现，所有数据遵循公式2描述的特征性指数分布。成束杆状体的平均停滞时间为43.6秒，单个杆状体为67.1秒；步长时间：20.6秒对比31.2秒；步长尺寸：36.4 nm对比22.2 nm；平均步速率：17.9 ± 2.0 nm/min对比10.4 ± 0.6 nm/min；所有这些差异都具有统计学意义。这些结果表明，成束杆状体的末端结合单体的效率明显高于单个杆状体。
域结构形成的模拟
在二维晶格上进行了蒙特卡洛模拟，以重现观察到的杆状体成束和域结构的形成。在我们的模拟中，当考虑杆状体之间的侧面相互作用时，杆状体似乎形成了域结构。当未定义侧面相互作用时，杆状体组装看起来是分散的。在这些模拟中，成束杆状体末端的延伸比单个杆状体更可能发生。为了量化杆状体取向，我们计算了角度对相关函数。强的侧面相互作用产生更大、更有序的域，而这些相互作用的减弱导致域变小且排列程度降低。在存在强侧面相互作用的情况下，对表面催化延伸事件和单个杆状体独立延伸事件的计数显示，前者比后者发生得更频繁。
lateral values: (A) εlateral= ?0.5 (lateral rodlet interactions included), (B) εlateral= 0.0 (lateral interactions not defined).">
讨论
我们使用高速原子力显微镜进行了批量分析和单杆状体观察，以阐明杆状体形成的动力学。CD光谱的检查显示，与其他I类疏水蛋白相似，RolA在单体自组装成由β折叠结构组成的杆状体过程中发生了构象变化。这一结果与Pham等人对I类疏水蛋白MPG1的研究一致；他们发现成核的快速进行阻碍了滞后期的检测。RolA反应曲线的形状也可能是由于快速的成核步骤。在没有空气-水界面的情况下，未观察到ThT荧光增加，表明RolA需要疏水表面进行成核。这与之前关于RolA和其他I类疏水蛋白的研究一致。虽然ThT测定允许对反应曲线进行动力学模型分析，但它仅提供整个系统的表观反应速率，限制了分析范围，并阻碍了对RolA特定结构变化和杆状体形成动力学的详细研究。
通过使用高速原子力显微镜，我们在单纤维水平实时监测了杆状体形成，并分析了其构象动力学和动力学。我们的观察表明，RolA在基底上自组装形成球状结构，这些结构转变为杆状体并进一步延伸。这些结构可能代表RolA单体处于特定的瞬态构象状态或具有聚集能力的寡聚体。包括RolA在内的疏水蛋白是大约10 kDa的分子，直径约为3 nm，但其结构大部分由柔性环区域组成。因此，通过原子力显微镜测量的单体高度可能因其构象状态而异。例如，在α-突触核蛋白中，单体高度范围在1到5 nm之间，具体取决于结构状态。考虑到观察到的RolA球状结构的大小，它们可能是特定构象的单体或小寡聚体，但无论如何，它们很可能被视为杆状体的前体。高速原子力显微镜还检测到未转化为杆状体的球状结构。由于这些结构往往比杆状体前体大，它们可能是偏离正轨的误组装RolA寡聚体或被困在错误构象状态的单体。高速原子力显微镜分析还显示，杆状体末端在生长和暂停状态之间交替。这表明杆状体末端采用了两种不同的构象状态：一种允许单体结合和杆状体延伸，另一种阻止单体结合，正如之前所提出的。这种逐步机制可能是淀粉样纤维延伸的普遍机制，因为它在参与细菌生物膜发育的功能性淀粉样蛋白和致病性淀粉样蛋白形成中也观察到了。
我们的高速原子力显微镜观察还显示，杆状体在延伸方向上的极性较低。一般来说，淀粉样纤维在延伸方向上具有很强的极性。例如，对Aβ、α-突触核蛋白和Sup35等特征明确的淀粉样蛋白纤维的高速原子力显微镜和荧光显微镜研究表明，它们从一端单向延伸，或者两端的延伸速率差异显著。高度极化的延伸也在参与细菌生物膜形成的分泌性功能性淀粉样蛋白CsgA的高速原子力显微镜观察中观察到。我们的高速原子力显微镜分析显示，RolA杆状体具有一定程度的极性，但从两端延伸。双向延伸可能为杆状体薄膜形成提供优势，特别是在成核率低的环境中，可以从有限数量的核更有效地增加杆状体质量。
本研究最引人注目的发现之一是，成束杆状体的延伸速率大约是单个杆状体的两倍，这表明相邻杆状体之间的相互作用促进了延伸。延伸速率的增加可能是由于成束导致杆状体末端局部环境的变化。成束杆状体的平均停滞时间和步长时间更短，平均步长尺寸和步速率更大。估计平衡常数Kd= kopen/kclose，其中kopen= 1/τ停滞时间，kclose= 1/τ步长时间；成束杆状体的Kd为2.12，单个杆状体为2.15，表明两种条件之间没有显著差异。这表明生长和暂停状态之间的化学势差无论杆状体是单个还是成束都保持大致恒定。然而，成束杆状体中末端在暂停和生长状态之间转换的频率显著更高，表明该反应的能量势垒比单个杆状体低。这些结果与催化的基本概念一致，即反应速率增加而不改变反应物和产物的化学势，因此结果表明杆状体充当了相邻杆状体末端结构变化的催化剂。然而，仅凭这一点并不能解释成束杆状体比单个杆状体更高的延伸速率。ThT测定的数据拟合表明，RolA以停靠-锁定类似的方式延伸，并且锁定过程是整个反应的限速步骤，因此杆状体延伸必须被视为一个多步反应：[暂停状态] ? [生长状态] + [单体] ? [生长状态 + 中间体] → [延伸的杆状体]。在这种情况下，当杆状体成束时，锁定过程也被认为得到了促进。成束杆状体中步速率的增加表明锁定过程的能量势垒降低。杆状体表面可以被视为一个反应场，催化杆状体末端的结构平衡以及锁定过程，从而增加成束杆状体的延伸速率。对于分子机制，有三种可能的解释。i) 杆状体末端的结构变化促进了结构平衡和锁定过程。分子动力学模拟表明，淀粉样纤维末端的结构波动影响纤维延伸。ii) 已停靠但未锁定的RolA可能与邻近杆状体相互作用，从而影响延伸。iii) RolA单体可能附着并集中在杆状体表面，增加了它们与邻近杆状体末端相互作用的概率。相比之下，锁定过程与单体浓度无关，因此不太可能受到这种影响，但成束杆状体中暂停状态时间的减少可能可以通过这种单体浓度效应来解释。如果将淀粉样纤维延伸视为一维晶体生长，则更容易理解这种效应。在结晶过程中，单体结合到晶体表面，扩散，并在扭结位点并入晶体。在淀粉样纤维生长模型中，结合到纤维表面的单体沿侧面扩散，并在纤维末端并入。在由不同长度纤维组成的结构中，长杆状体的侧面可被视为对应于平台，短杆状体的末端对应于扭结位点。单体吸附到杆状体侧面导致局部浓度高于本体溶液，从而促进随后的杆状体延伸。尽管详细的分子机制尚不清楚，但杆状体肯定在邻近杆状体末端的结构平衡和延伸中都起到了催化作用。因此，我们建议将RolA杆状体形成途径称为“表面催化延伸”，并认为这一概念对于理解杆状体成束至关重要。
淀粉样聚集中的表面催化涉及二级成核，其中纤维表面的成核被强烈促进；逆反应——寡聚体解离——也被促进，使纤维充当催化剂。表面催化延伸不同于二级成核，因为它促进杆状体延伸而不是寡聚体形成。二级成核导致总纤维质量快速增加。表面催化延伸可能对总纤维质量的影响有限，因为形成的杆状体保持紧密堆积成束，先前活跃的催化位点被掩埋，阻止了其数量的净增加。表面催化延伸可能调节纤维排列，有助于形成有序的致密杆状体薄膜。为了支持这一假设，我们进行了蒙特卡洛模拟以重现杆状体成束和随后的域结构形成。在我们的模拟中，在强侧面相互作用的条件下，杆状体形成了域结构。我们模拟结构的外观与Zykwinska等人进行的粗粒度模拟结果相似。这些结果表明，我们的模拟成功地再现了高速原子力显微镜无法完全捕获的长时间尺度的杆状体薄膜形成过程。对这些模拟结果的进一步详细分析定量地证明了杆状体的侧面相互作用既促进了域的扩大，又增强了排列，加强了高速原子力显微镜观察到的局部现象可以广泛影响整个杆状体薄膜形成的假设。杆状体之间的侧面相互作用很可能由暴露在杆状体表面的单个疏水蛋白分子的特定氨基酸残基介导。然而，整个杆状体组装的确切三维结构仍然难以捉摸。需要进一步的结构分析来阐明表面催化延伸的分子机制。
纤维的成束和有序排列在一些覆盖细胞表面的功能性淀粉样蛋白中常见，例如丝状真菌的疏水蛋白和天蓝色链霉菌的chaplins。在我们的高速原子力显微镜分析中，我们从成熟杆状体组装的角度研究了不仅单个杆状体的形成，还包括杆状体薄膜的形成。这种杆状体薄膜形成的机制可能通过支持细胞表面结构的发育，对特定物种的形态发生有所贡献。
我们使用高速原子力显微镜在单纤维水平分析了疏水蛋白RolA的杆状体形成动力学，揭示了几个有趣的现象：i) 杆状体末端采用两种不同的结构状态：生长状态和暂停状态；ii) 杆状体双向延伸，同时保持极性，尽管两端的生长速率差异不大；以及本研究最重要的发现，即 iii) 一个先前未被认识的途径——“表面催化延伸”——控制着杆状体末端的结构平衡和延伸。由于杆状体通过侧面相互作用，我们认为表面催化延伸增强了它们组装的效率。这项工作代表了理解杆状体形成细胞表面结构机制的概念性进展。
