具有Ig样结构域1的粘附分子通过与TGFRII相互作用，通过TGFβ/Smad信号通路调节颈动脉斑块的稳定性

《Cellular Signalling》：Adhesion molecule with Ig-like domain 1 regulates stability of carotid plaque via TGFβ/Smad signaling pathway by interaction with TGFRII

动脉粥样硬化斑块稳定性受AMIGO1调控，其通过促进内皮细胞粘附、抑制炎症因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）及激活TGFβ/SMAD信号通路（AMIGO1-TGFRII相互作用）增强斑块稳定性，动物模型验证其疗效且被SB431542抑制。

　　

Xintao Hu | Xiaoqing Li | Jichong Chen | Yang Li | Zhao Zhao | Xiangyang Yin | Shichao Duan | Bing Wang

郑州大学第五附属医院血管外科，中国河南省郑州市二七区康福前街3号，450052。

摘要

颈动脉粥样硬化是心血管和脑血管疾病的重要风险因素。维持斑块的稳定性可以防止斑块破裂和血栓形成，减缓疾病进展，对于预防脑血管事件（如中风、短暂性脑缺血发作（TIA）等）至关重要。影响斑块稳定性的机制尚不明确。在本研究中，我们从患者体内收集了稳定斑块（n = 5）和不稳定斑块（n = 5），并使用RNA测序进行了分析。RNA测序发现了594个差异表达基因。通过KEGG分析，差异表达基因富集的通路包括炎症相关通路、细胞粘附相关通路和TGFβ信号通路。特别是，我们发现AMIGO1在稳定斑块中显著上调。包括细胞粘附和炎症相关因子检测在内的功能实验表明，AMIGO1显著促进内皮细胞粘附，同时下调炎症细胞因子（如IL-6、IL-1β、TNF-α）的产生，从而减轻炎症反应。共免疫沉淀（Co-IP）实验进一步发现，AMIGO1与转化生长因子β受体II（TGFRII）相互作用，稳定TGFRII蛋白水平，进而激活TGFβ信号通路。通过AAV9病毒尾静脉注射AMIGO1过表达，在高脂饮食结合外科干预的ApoE^?/^?小鼠颈动脉粥样硬化模型中，斑块显著稳定，表现为纤维帽增厚、脂质沉积减少和免疫细胞浸润降低。这些保护作用在同时给予SB431542后消失。临床样本的免疫荧光和Western blot分析证实，AMIGO1通过上调TGFRII水平来增强颈动脉斑块的稳定性。我们的综合数据表明，AMIGO1通过与TGFRII相互作用，激活TGFβ/SMAD通路，从而调节内皮细胞粘附并下调炎症细胞因子的产生，进而调节斑块稳定性。本研究为开发临床疗法和CAS的新靶点提供了重要的理论基础。

引言

颈动脉粥样硬化（CAS）是一种常见的动脉疾病，由脂质沉积、炎症反应和血管内皮损伤引起[1]。其病理特征主要表现为动脉壁中的斑块形成。这些斑块可能导致血管狭窄，并在严重情况下引发致命的心血管/脑血管事件，如中风和心肌梗死[2,3]。不稳定斑块的特点是纤维帽薄且炎症细胞丰富，容易破裂并形成急性血栓，显著增加致命事件的风险[[4], [5], [6]]。尽管现有的药物和外科干预措施可以延缓疾病进展，但斑块破裂缺乏特定的症状前指标，使得通过常规检查（如影像学或生物标志物）进行预测和干预变得具有挑战性[[7], [8], [9]]。二十年前，发现TGFβ1在稳定斑块中上调，这表明TGFβ信号通路在防止斑块向不稳定表型转变中起作用[10,11]。最近的研究表明，TGFβ2是人类斑块中最丰富的TGFβ亚型，可能通过减少炎症和基质降解来维持斑块稳定性[12]。然而，TGFβ信号通路如何调节斑块稳定性仍不清楚。因此，阐明斑块不稳定性的分子机制并确定关键治疗靶点对于CAS的早期诊断和治疗至关重要。

在本研究中，我们从临床患者中收集了稳定斑块和不稳定斑块进行RNA测序（RNA-seq）分析，发现两组之间存在594个差异表达基因。通过KEGG分析，差异表达基因富集的通路包括炎症相关通路、细胞粘附相关通路和TGFβ信号通路，先前的研究已报道这些通路调节颈动脉斑块的稳定性[[13], [14], [15], [16], [17], [18]]。RNA-seq结果显示，具有Ig样结构域1的粘附分子（AMIGO1）在稳定斑块中显著上调。作为一种细胞粘附分子，最近的研究强调了其在血管生物学和神经元中的关键作用[[19], [20], [21]]。因此，我们假设AMIGO1可能通过调节炎症反应、细胞粘附和TGFβ信号通路来调节CAS中的斑块稳定性。

血管内皮细胞在CAS的进展中起着关键作用[[22], [23], [24]]。它们的屏障功能、炎症状态和细胞间相互作用直接影响斑块的形成和稳定性[[25], [26], [27]]。为了研究AMIGO1是否调节HUVECs并影响斑块的形成和稳定性，我们在HUVECs中过表达和敲低了AMIGO1。包括细胞粘附和炎症相关因子检测在内的功能实验表明，AMIGO1显著促进内皮细胞粘附，同时下调炎症细胞因子（如IL-6、IL-1β、TNF-α）的产生，从而减轻炎症反应。

共免疫沉淀（Co-IP）实验进一步发现，AMIGO1与TGFβ通路的受体TGFRII相互作用，稳定TGFRII蛋白水平，进而激活TGFβ信号通路。尽管TGFβ信号通路对于维持血管稳态和调节炎症至关重要[29,30]，但AMIGO1是否通过这一通路调节颈动脉斑块稳定性仍不清楚。因此，我们用SB431542（一种TGFβ受体抑制剂）处理过表达AMIGO1的细胞[31]，这减弱了AMIGO1过表达引起的效果，证实AMIGO1通过激活TGFβ信号通路来调节内皮细胞功能。

为了验证AMIGO1在体内的作用，我们通过高脂饮食结合外科干预建立了ApoE^?/^?小鼠颈动脉粥样硬化模型[32]。模型组小鼠表现出斑块面积增大和AMIGO1表达降低。AMIGO1过表达显著稳定斑块，表现为纤维帽增厚、脂质沉积减少和免疫细胞浸润降低。这些保护作用在同时给予SB431542后消失。

临床样本的免疫荧光和Western blot分析证实，AMIGO1通过上调TGFRII水平来增强颈动脉斑块的稳定性。本研究为开发CAS的临床疗法和新的靶点提供了重要的理论基础。

颈动脉粥样硬化患者斑块样本收集标准

稳定和不稳定颈动脉斑块样本来自郑州大学第五附属医院（KY2024001-K02）的颈动脉粥样硬化患者。稳定斑块组有5个样本，不稳定斑块组也有5个样本用于RNA测序，两组临床患者的基线特征在表1中描述。稳定斑块组有7个样本，不稳定斑块组也有7个样本用于免疫荧光染色

AMIGO1在不稳定颈动脉斑块中下调

为了筛选新的颈动脉斑块稳定性调节因子，我们收集了5个稳定斑块和5个不稳定斑块并进行转录组测序。生物信息学分析数据显示，不稳定斑块中有278个基因上调，316个基因下调，15,247个基因在两组中的水平没有差异（图1A）。通过KEGG分析，差异表达基因富集的通路包括炎症相关通路

讨论

颈动脉粥样硬化（CAS）是心血管和脑血管疾病的重要风险因素[[1], [2], [3]]。维持斑块稳定性可以防止斑块破裂和血栓形成，减缓疾病进展，对于预防脑血管事件至关重要。影响斑块稳定性的机制包括：内皮细胞的细胞粘附；炎症反应；斑块内的血管生成（斑块内的新血管形成）；斑块内的细胞外基质组成

资助

本研究得到了河南省周围血管疾病医学重点实验室的支持（xkpb2022001）。

伦理批准

颈动脉斑块的收集得到了郑州大学第五附属医院医学伦理委员会的批准（KY2024001-K02）。所有人类样本的采集均遵循赫尔辛基宣言。已从患者处获得知情同意书。所有动物研究均获得了郑州大学第五附属医院实验动物伦理委员会的批准（KY-D-2024063）。

CRediT作者贡献声明

Xintao Hu：撰写——原始草案、方法学、研究、概念构思。Xiaoqing Li：研究。Jichong Chen：研究。Yang Li：研究。Zhao Zhao：研究。Xiangyang Yin：研究。Shichao Duan：撰写——原始草案、概念构思。Bing Wang：撰写——原始草案、监督、资金获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明我们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。