《Cellular Signalling》：The Wnt signaling pathway plays a key role in regulating the pluripotent state of rbESCs and promoting their commitment to the primordial germ cell fate
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研究调节Wnt信号通路对兔胚胎干细胞（rbESCs）多能性和生殖细胞分化能力的影响，发现Wnt/β-catenin通路调控可重塑rbESCs多能态并增强其增殖能力，同时促进其向原生殖细胞样细胞（PGCLCs）分化，且分化细胞与体内原生殖细胞更相似。
吴永梅|高子燕|张瑞敏|农天英|魏汉丽|吕乔|梁静远|杨彦彦|潘宇|程娟如|邹凌秀|邓艳飞
中国广西大学动物科学与技术学院动物繁殖与疾病控制与预防重点实验室，南宁530004
摘要
体外配子发生（IVG）的研究为探究生殖细胞发育机制和保护优质畜禽种质资源提供了新的方法。兔子是一种理想的动物模型，非常适合作为初步研究的对象。然而，普遍认为兔胚胎干细胞（rbESCs）的多能状态已经处于“启动”状态，这限制了它们的分化潜能。鉴于Wnt信号通路在调控ESC多能性中的重要作用，本研究探讨了调节该通路如何影响rbESCs的多能状态及其分化潜能。结果表明，调节Wnt信号通路足以重塑rbESCs的多能状态并显著增强其增殖能力。此外，在诱导其向原始生殖细胞（PGCs）分化过程中，发现rbESCs具有向兔原始生殖细胞样细胞（rbPGCLCs）分化的倾向。而且，在Wnt信号通路的作用下，形成的rbPGCLCs与体内的PGCs更为相似。转录组分析进一步证实，Wnt信号通路不仅调控rbESCs的多能性，还增强了它们分化为PGCs的能力。总之，我们的研究结果表明，调节WNT信号通路可以提升rbESCs的多能性和生殖细胞定向能力。
引言
胚胎干细胞（ESCs）的多能状态可分为“启动”状态和“幼稚”状态[1]。小鼠胚胎干细胞（mESCs）属于幼稚状态，而上皮干细胞（EpiSCs）则属于启动状态[2]。随着研究的深入，已经分离出了具有全能性的类囊胚细胞（TBLCs）、扩增潜能干细胞（EPSCs）和形成性多能干细胞（FSs）[3,4]。TBLCs在分子水平上与2细胞和4细胞囊胚相当[3,4]。EPSCs既可参与胚胎本身的形成，也可参与嵌合实验中的滋养外胚层发育[5,6]。FSs处于幼稚多能性和启动多能性之间的中间状态[7,8]，它具有直接分化为原始生殖细胞（PGCs）并形成嵌合体的独特能力。虽然幼稚状态的ESCs具有生殖细胞传递能力，但在体外难以直接生成原始生殖细胞样细胞（PGCLCs）。相比之下，启动状态的ESCs既无法形成嵌合体，也无法诱导出PGCLCs。兔胚胎干细胞（rbESCs）的多能状态介于启动状态和幼稚状态之间[9]，这可能代表了一种形成性状态，但尚未得到验证。
研究人员一直在努力探索提高rbESCs多能性的方法。以往用于提高人类和猴子ESC多能性的培养系统（如NHSM[10]、5iLA[11]、t2iLG?Y[12]和LCDM[13]）对rbESCs无效。相比之下，R5i培养系统能够支持兔诱导多能干细胞（rbiPSCs）形成类似mESCs的圆顶状菌落，但其多能性尚未得到验证[14]。这可能表明，不同物种在调控rbESCs幼稚多能性的信号通路方面存在差异。
Wnt通路在调控多能干细胞（PSCs）的多能状态中起着关键作用。在2i（CHIR99021, PD0325901）/LIF存在的情况下，添加选择性抑制Wnt/β-连环蛋白信号通路的药物XAV939，可以促进人类胚胎干细胞（hESCs）向幼稚状态转变，并帮助mESCs转化为EPSCs[15],[16],[17],[18]。尽管XAV939能增强ESC的多能性，但它无法维持其长期自我更新能力。然而，通过与CHIR99021的协同作用可以克服这一限制[19]。小分子抑制剂CHIR99021可作为Wnt/β-连环蛋白信号通路的激活剂，促进细胞增殖[20]，并且在FS的生成中也起着重要作用[21]。总之，Wnt/β-连环蛋白信号通路对于多能性的获得和维持至关重要。
为了探究Wnt/β-连环蛋白信号通路是否在调控rbESCs的多能性中发挥类似作用，我们进行了以下研究。通过添加bFGF、CHIR99021和XAV939的培养条件，成功增强了从兔囊胚中提取的rbESCs的多能性，同时提高了其细胞活力。在生殖细胞定向能力方面，rbESCs在体外仅通过骨形态发生蛋白4（BMP4）的作用即可直接分化为PGCLCs。此外，经过Wnt/β-连环蛋白信号通路调节的rbESCs表现出更强的分化为PGCLCs的能力，且形成的PGCLCs与体内迁移阶段的PGCs更为相似。
实验部分
兔胚胎的收集
使用生理盐水从日本巨型兔子的子宫中冲洗出E3.5–4.0期的胚胎，以获得植入前胚胎。所有实验均遵循广西大学动物护理和使用委员会的指导原则（GXU-2025-114）。
胚胎成纤维细胞的分离与培养
从E13.5期小鼠胎儿和E17–20期兔胎儿的背部皮肤中分离组织，用手术剪刀切成细碎块后用胰蛋白酶消化20分钟，然后用Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM, Gibco）终止消化过程。
兔胚胎干细胞的分离
目前关于rbESCs的基础培养体系仍存在争议，尚未明确bFGF通路和LIF通路哪个起主导作用[29,30]。本研究发现，bFGF能够稳定支持rbESCs的分化。从E3.5–4期囊胚中机械分离出内细胞团（ICM），然后用胰蛋白酶消化得到单细胞悬浮液，随后将这些细胞培养在含有bFGF的培养基中，并使用有丝分裂抑制剂处理的MEFs作为饲养层。
讨论
我们研究了Wnt/β-连环蛋白信号通路相关抑制剂在维持来自E3.5–4期囊胚的rbESCs多能性和生殖细胞定向中的作用。研究证实，bFGF单独使用即可支持rbESCs的分离和多能性的维持。而CHIR99021和XAV939的联合使用则能使rbESCs形成圆顶状菌落，重塑其多能性并增强其增殖能力。
作者贡献声明
吴永梅：数据可视化、验证、软件使用、资源获取、方法设计、实验设计、资金申请、数据分析、概念构建、初稿撰写。高子燕：数据可视化、软件使用、方法设计、实验设计、数据分析、修订与编辑。张瑞敏：数据验证、资源获取、实验设计、数据分析。农天英：数据可视化、验证、方法设计。魏汉丽：数据可视化、验证。
资助
本研究得到了广西自然科学基金（2022GXNSFDA035064, 2025JJB130372）和国家自然科学基金（31760334）的支持。
诱导多能干细胞
rbiPSCs兔诱导多能干细胞TBLCs全能性类囊胚细胞 | EPSCs扩增潜能干细胞 | FS | 形成性多能干细胞 | PSCs | 多能干细胞 | MEFs | 小鼠 |
