富含载脂蛋白E的蛋白质层能够增强β-折叠断裂肽功能化金纳米颗粒在血脑屏障中的转运能力

蛋白质层工程通过预加载载脂蛋白E（ApoE）增强β-折叠破坏肽修饰的金纳米颗粒的血脑屏障穿透能力，实验表明ApoE可显著促进纳米颗粒的转运及脑内蓄积，证实蛋白质层工程是靶向递送的实用策略。

　　

西蒙·格雷罗（Simón Guerrero）|娜塔莉亚·哈桑（Natalia Hassan）|埃迪森·萨拉斯-韦努莱奥（Edison Salas-Huenuleo）|伊塔洛·莫利亚（Italo Moglia）|罗杰·普拉德斯（Roger Prades）|索兰热·马萨（Solange Massa）|梅里特塞尔·特希多（Meritxell Teixido）|范妮·古兹曼（Fanny Guzman）|欧内斯特·吉拉尔特（Ernest Giralt）|费尔南多·阿尔贝里西奥（Fernando Albericio）|埃利亚安德烈·德奥利维拉（Eliandre de Oliveira）|艾琳·阿拉亚（Eyleen Araya）|马塞洛·J·科根（Marcelo J. Kogan）

智利大学化学与药学学院，圣地亚哥，智利

摘要

在生物环境中，由蛋白质冠层定义的瞬态、异质性的纳米生物界面决定了纳米材料的生物分布、免疫识别、代谢和清除。这种冠层远非缺点，当其组成可以被可预测地调整或有意调节时，它可以被用于靶向纳米药物的递送。我们假设，预先加载载脂蛋白E（ApoE）——此前已被确定为具有β-折叠破坏肽功能的金纳米粒子冠层的组成部分——将增强纳米粒子穿过血脑屏障（BBB）的传输并增加在大脑中的吸收。为了验证这一点，我们合成了用CLPFFD或THRPPMWSPVWPCLPFFD肽功能化的金纳米粒子（AuNPs，约12纳米），这两种肽都含有能够识别与阿尔茨海默病相关的β-淀粉样蛋白聚集体的LPFFD基序。与人类血浆孵育后，通过2D IEF/SDS-PAGE和LC-MS/MS对硬质冠层蛋白进行了分析。根据蛋白质在纳米粒子转运和BBB跨细胞转运中的作用对它们进行了排序，并因ApoE的频繁出现而选择对其进行富集。在体外BBB模型和体内生物分布实验中评估了装载ApoE的AuNP-f的效果，使用的是Sprague-Dawley大鼠。体外评估了大脑中的积累情况。结果显示，在体外，预先加载ApoE显著增强了纳米粒子穿过BBB的传输，并增加了大鼠大脑中的积累。这些结果表明，合理地用ApoE富集冠层可以在不改变纳米粒子表面化学性质的情况下改善BBB转运和大脑积累。因此，冠层工程为脑靶向纳米药物递送提供了一条实用的方法，并可能扩展到其他蛋白质-受体轴以实现器官特异性靶向。

引言

在过去的二十年里，纳米技术在生物医学应用中努力揭示控制新型生物工具性能的生物学复杂性。[1],[2],[3],[4] 阿尔茨海默病（AD）治疗方法的发展引起了对纳米技术的兴趣；其中一种方法涉及使用用β-折叠破坏肽功能化的金纳米粒子（AuNPs），这些肽能够选择性地结合β-淀粉样蛋白（Aβ）聚集体并促进其解聚，从而减轻其神经毒性。这些病理聚集体滞留在血脑屏障（BBB）后面，这是一个高度选择性的内皮界面，阻挡了≥98%的循环治疗药物进入大脑。[5] 因此，克服这一屏障并实现高效的中枢神经系统（CNS）递送仍然是纳米医学AD治疗的主要挑战之一。[4],[6],[7],[8]

多年来，我们的团队通过硫醇-金化学吸附系统地优化了AuNPs的大脑递送。我们之前已经证明，用多个β-折叠破坏肽CLPFFD功能化的AuNPs与未修饰的AuNPs（裸露的AuNPs）相比，大脑中的积累量增加了四倍。[9],[10] 在后续研究中，在N端添加了脑转运序列THRPPMWSPVWP [11]，得到了混合肽THRPPMWSPVWP-CLPFFD，使大脑吸收量增加了约20倍。[7],[12] 尽管取得了这些进展，但实际递送到CNS的剂量仅约为注射剂量的0.3%，这突显了需要进一步策略来更有效地突破BBB。

当纳米粒子（NPs）进入血液时，会迅速吸附血浆蛋白，形成一个动态的蛋白质冠层，赋予它们新的生物学特性。[13],[14] 这种转变可能显著影响NPs在体内的行为，调节其循环半衰期、免疫原性、单核吞噬细胞系统（MPS）的清除，或器官生物分布，导致它们在肝脏和脾脏等器官中的滞留，并改变它们的系统驻留时间，从而减少对特定目标的递送。[15],[16],[17] 一方面，调理作用可以使NPs被MPS快速隔离，加速肝脏和脾脏的清除，同时大幅减少对优先部位的递送，包括实体肿瘤或难以到达的位置，如CNS内的β-淀粉样蛋白。相反，选择性富集“隐形”或转运配体可以延长循环时间，并引导受体介导的跨生物屏障的转运，从而增强某些治疗效果。[16],[18],[19],[20],[21],[22] 因此，详细了解NPs在体内的行为，特别是蛋白质冠层的组成和时空动态，对于治疗和诊断纳米医学的进步至关重要。[23] 冠层可能会重塑NPs的关键物理化学属性，包括流体动力学直径、形态、界面化学、表面官能团、ζ电位和聚集，从而赋予它们第二种生物学特性。[24] 这种新的特性决定了NPs与生理环境（包括血液、间质液和细胞质）的相互作用，决定了它们的细胞识别和吸收，最终决定了药代动力学、器官生物分布和毒理学特性。[16],[25],[26],[27],[28] 因此，当NPs暴露在生物介质中时，它们被预期目标的识别可能会改变，可能影响合理设计策略的有效性。[29] 对于AuNPs来说，它们与血浆蛋白的相互作用受动力学和热力学因素的共同影响，这些因素共同决定了蛋白质冠层的形成和稳定性。[30] 然而，硬质冠层通过静电和疏水相互作用牢固地吸附在NP表面，并且在动态的生物环境中似乎是稳定的，能够长时间保持附着。[31] 尽管有大量研究记录了蛋白质冠层，但只有少数研究有意工程化或预先组装了NPs的蛋白质冠层以影响其在体内的命运。[32],[33],[34],[35],[36],[37] 最近的综述将这种策略称为“内源性靶向”，[38] 即通过选择性地将宿主蛋白吸附到纳米粒子表面来调节器官趋向性。[39] 然而，将这一概念应用于BBB转运和神经退行性疾病的应用仍然相对较少。因此，我们将载脂蛋白E（ApoE）预先加载到具有β-折叠破坏肽功能的AuNPs上的策略是一种强大的方法，用于重新工程化冠层组成并实现高效的大脑靶向递送。基于这些考虑，我们假设肽功能化的AuNPs可以招募内源性配体来塑造它们的生物命运，而ApoE——始终在其血浆衍生的冠层中被发现——可能作为BBB跨细胞转运的自然促进剂。因此，我们认为在生物暴露之前人工富集NP冠层中的ApoE可能会增强受体介导的BBB转运并改善大脑递送。

为了验证这一假设，我们首先表征了血浆衍生的冠层作为生物学相关的基线，以识别能够促进NPs穿过BBB进入CNS的内源性配体。蛋白质组学一致显示ApoE是LDLR和LRP1家族的典型配体，它们介导受体介导的BBB跨细胞转运[8],[40],[41]，是冠层的主要成分。这一发现促使我们通过将AuNP-f与纯化的ApoE预先孵育来生成一个有意富集ApoE的冠层，设计出一个富含ApoE的仿生冠层，作为“特洛伊木马”来增强NPs进入大脑的能力。这种方法补充了之前关于各种穿越BBB策略的研究，但在机制上不同于之前将ApoE或其模拟肽共价附着到纳米粒子表面的策略。[42],[43],[44] 相反，我们的设计侧重于通过控制冠层富集来重新设计NPs的生物学特性，例如“特洛伊木马”策略，为脑靶向纳米医学提供了概念上的不同途径，并为未来的治疗和诊断生物工具提供了多用途的蓝图。

实验部分

完整协议见补充信息。表S1列出了所有试剂的规格和试剂目录编号。

CRediT作者贡献声明

梅里特塞尔·特希多（Meritxell Teixido）：写作——审稿与编辑、验证、方法学、研究、正式分析、数据管理。索兰热·马萨（Solange Massa）：写作——审稿与编辑、验证、研究、正式分析、数据管理。欧内斯特·吉拉尔特（Ernest Giralt）：写作——审稿与编辑、资源管理、概念化。范妮·古兹曼（Fanny Guzmán）：写作——审稿与编辑、验证、方法学、数据管理。罗杰·普拉德斯（Roger Prades）：写作——审稿与编辑、验证、方法学、研究、正式分析、数据管理。伊塔洛（Italo）

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文报告的工作。

致谢

作者感谢智利国家研究与发展机构（ANID）的支持，该机构隶属于科学、技术、知识与创新部。