综述：将黑曲霉（Aspergillus niger）培育成为新一代用于生产L-苹果酸的细胞工厂

《Current Opinion in Biotechnology》：Shaping Aspergillus niger into a next-generation cell factory for L-malic acid

L-苹果酸微生物发酵工艺优化及系统代谢工程进展研究，重点阐述丝状真菌A. niger通过代谢通路重构与合成生物学技术提升产率，同时分析下游处理与工艺强化挑战。

　　

刘赫|常美怡|张琪|徐青

中国江苏省南京市南京师范大学微生物技术国家重点实验室，邮编210000

L-苹果酸作为一种多功能平台化学品，越来越多地通过可持续的微生物发酵生产。丝状真菌黑曲霉因其天然的生产能力和代谢多样性而成为工业生产的首选细胞工厂。本综述总结了在黑曲霉中阐明和改造L-苹果酸生物合成途径的最新进展。重点关注系统代谢工程和关键使能工具，这些工具共同将碳流重新导向以增强L-苹果酸的合成。我们进一步讨论了工业化放大过程中存在的持续挑战，包括工艺强化和下游处理，并概述了将系统生物学与创新生物工艺技术相结合的前景，以提高微生物L-苹果酸生产的经济可行性。

引言

L-苹果酸是一种关键的C4二羧酸，也是重要的生物基平台化学品，在多个工业领域得到广泛应用1, 2。它在食品工业中用作风味增强剂和酸化剂，在药物配方中作为药用添加剂，在日用化学品行业中作为金属清洁剂[3]。由于其工业重要性，L-苹果酸被美国能源部列为12种最重要的生物基平台化学品之一4, 5。全球年需求量超过20万吨，这为向更可持续的制造模式转型提供了强劲的动力[6]。

微生物发酵是生产L-苹果酸的一种有利途径，因为它能与多种可再生原料和微生物宿主兼容。这种方法显著提高了工艺灵活性，并减少了对化石资源的依赖7, 8。在已建立的生物工艺中，黑曲霉是最主要的工业生产者[9]。由于具有公认的安全性（GRAS）和天然的酸分泌能力，黑曲霉被确立为顶级微生物细胞工厂10, 11••。凭借这些优势，常州浩禾生物技术有限公司在2024年10月实现了年产量达300吨、纯度符合国际标准的L-苹果酸生产目标[12]。

系统代谢工程的最新进展为黑曲霉中高效生产L-苹果酸开启了新时代7, 13。然而，仍存在一些挑战，如菌株效率不高、底物转化率低、副产物生成以及下游处理效率低下[1]。克服这些瓶颈对于实现经济竞争力至关重要。从实验室成功向成本效益高的工业生产过渡仍然是一个系统性挑战。令人鼓舞的是，系统代谢工程和合成生物学的持续进步正在推动从传统菌株改良向代谢网络精准重构的战略转变[8]。

本综述探讨了构建高产L-苹果酸微生物细胞工厂的先进策略，重点关注代谢流调节、创新使能技术和集成生物工艺优化。我们还讨论了如何将下游处理与菌株工程相结合，以实现经济上有竞争力的L-苹果酸生物生产。

部分摘录

系统代谢工程以实现精准控制

在黑曲霉中，L-苹果酸通过还原性三羧酸（rTCA）循环合成。由于其高产率和相对简单的过程，这条路线被认为是生产L-苹果酸最经济的方法[11]。该过程发生在细胞质中，涉及两个关键酶步骤。首先，丙酮酸羧化酶（PYC）催化丙酮酸在ATP的作用下转化为草酰乙酸（OAA）。随后，生成的OAA被烟酰胺腺嘌呤二核苷酸还原为L-苹果酸

创新使能技术

合成生物学的进步产生了一系列使能技术，共同推动了L-苹果酸的工业规模生产（图2）。这些技术构成了构建微生物细胞工厂的强大工具箱，包括从精确基因组编辑到整体细胞优化的各种方法，共同促进了生产性能的系统提升。精确基因组编辑系统，如

集成生物处理

使用工程改造的黑曲霉进行L-苹果酸的工业规模生产严重依赖于先进的生物工艺设计[12]（表1）。当前有机酸回收方案存在一个根本性挑战：该过程依赖CaCO₃进行pH值调节，从而导致苹果酸钙的形成。这又需要使用强酸（如H₂SO₄）来再生游离酸。这种方法会产生大量石膏（CaSO₄

结论与未来展望

黑曲霉已被确立为工业规模生产L-苹果酸的强大微生物细胞工厂。目前，该领域正从单一途径工程向代谢网络的全面重编程转变。为了加速这一转变，未来的研究应优先考虑三个关键领域：（i）采用多组学数据驱动的设计来构建高度准确的预测模型；（ii）扩展合成生物学工具箱，特别是通过

CRediT作者贡献声明

刘赫：研究、撰写——原始草稿、可视化、资金获取。常美怡：资源提供。张琪：撰写——审稿与编辑。徐青：概念构思、资源提供、撰写——审稿与编辑、监督、资金获取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：22378210）、江苏省自然科学基金（编号：BK20250627和BK20250037）以及江苏省高等学校研究项目（编号：25KJB530004）的支持。