《PLOS Biology》：Synapse types are spatially associated with regional hemodynamics in the mouse brain
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本文通过整合单点突触成像与功能磁共振成像（fMRI）技术，揭示了不同突触类型（如长寿命PSD95与SAP102）在小鼠大脑中的空间分布与区域性血氧水平依赖（BOLD）信号动态特征（如信号平稳性与高幅事件）密切相关，并进一步阐明了突触组成如何影响脑区的结构和功能网络嵌入。这一发现将微观突触表型与宏观全脑动力学联系起来，为理解大脑多尺度组织提供了新见解。
引言：从神经连接到突触表型
大脑由数十亿相互连接的神经元构成，支持电信号传递以及认知和行为的产生。所有神经回路中的一个基本单位是突触。以往的研究通常关注突触是否存在（即两个神经元是否连接），但一个常被忽视的问题是：存在何种类型的突触，以及这种突触表型如何塑造其功能。事实上，不同的兴奋性突触表达不同的神经递质受体、离子通道和信号复合物。这种突触蛋白的组合塑造了单个神经元的电压动力学。换句话说，大脑功能不仅源于复杂的神经连接模式，还源于每个接触点的特定突触表型。纳入大脑的突触异质性对于理解区域突触结构如何最终塑造区域大脑动力学和连接性至关重要。
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近年来，小鼠单点突触成像技术使得在全脑范围内对单个突触的蛋白质组组成进行成像成为可能，揭示了突触类型的巨大多样性——即“突触组”。其中，两个突触蛋白特别适合作为小鼠模型中的遗传标记：突触后密度蛋白95（PSD95）和突触相关蛋白102（SAP102）。这两种突触后支架蛋白在兴奋性突触中稳定且大量表达，能够将受体、通道和其他信号分子组装成多蛋白信号复合物，并在塑造突触对神经信号的反应中发挥直接作用。PSD95和SAP102突触还可以根据形态特征进一步分为多个亚型，每种亚型都具有独特的特性。例如，一些突触亚型在数周内稳定表达PSD95（“长寿命”突触），而其他突触亚型则在数小时内回收PSD95（“短寿命”突触），这可能是记忆、认知灵活性和学习的潜在机制。重要的是，仅表达PSD95的突触与仅表达SAP102的突触在大脑中的表达存在差异，使得每个大脑区域都有其自身独特的突触组成或突触组结构。
结果
突触类型密度图
研究人员使用荧光标记对两种突触蛋白——PSD95和SAP102——进行了成像，在单个小鼠全脑中检测了大约10亿个单独的突触点。对所有仅表达PSD95、仅表达SAP102以及PSD95/SAP102共定位突触的形态特征（例如大小、形状）进行了量化，并聚类为11种PSD95突触亚型、7种SAP102突触亚型和19种共定位突触亚型。这37种突触亚型的密度被映射到艾伦参考图谱的775个区域。
通过聚类突触密度相似性矩阵，研究人员发现所有SAP102突触亚型的空间表达模式相似。对于PSD95突触，他们发现了两个表达谱簇，这两个簇几乎完全与突触内PSD95的回收率（即PSD95寿命）一致。因此，他们分别分析了长寿命PSD95突触（6个亚型）和短寿命PSD95突触（5个亚型）。而PSD95/SAP102共定位突触的表达模式则遵循仅表达SAP102的突触（“SAP102样共定位突触”）或长寿命仅表达PSD95的突触（“PSD95样共定位突触”）的表达模式。因此，在正文中主要关注长寿命PSD95和SAP102突触。
为了将突触密度数据与结构（示踪）和功能（fMRI）数据集整合，他们将775个样本映射到结构数据（137个右半球区域）和功能数据（88个双侧区域）中包含的区域。对于每种突触类型——长寿命PSD95、短寿命PSD95和SAP102，他们展示了其在小鼠大脑轴向、冠状和矢状视图上的平均空间表达谱。所有突触类型在前部区域（如新皮层、皮层下板和嗅觉区）更为密集。长寿命PSD95和SAP102突触在冠状切片中显示出相反的背-腹密度梯度，长寿命PSD95突触在背部更密集，而SAP102突触在腹部更密集。短寿命PSD95突触密度在延髓最高，但在新皮层、嗅觉区和下板区域相对均匀。
突触类型与独特的宏观动力学相关
在单个突触水平，其分子构成和形态与独特的生理反应相关。但是，全脑突触密度是否映射到大脑活动的独特特征上呢？为了解答这个问题，研究人员分析了清醒小鼠的自发fMRI活动，并比较了血流动力学的区域变异与突触类型的区域变异。
视觉上，他们观察到具有不同突触密度的脑区的血氧水平依赖（BOLD）信号在质量上是不同的。例如，长寿命PSD95突触密度较高的区域的时间序列显得周期性更弱、变异性更强。同样，SAP102突触密度高的区域显示出高幅度事件。
为了全面表征每个脑区的动态特征，他们使用了高度比较时间序列分析工具箱（hctsa）来计算每只小鼠每个区域时间序列的数千个统计特征，包括自相关、熵、频率组成、信号幅度分布和可预测性等测量。然后，他们将每种突触类型与所有>6000个时间序列特征进行相关性分析（斯皮尔曼相关系数）。他们发现，长寿命PSD95突触密度与信号平稳性相关的特征最相关，因此具有更多长寿命PSD95突触的区域具有更低的平稳性和更多变的信号。这些特征簇可以用一个称为StatAv的简单统计量来概括，它定义为n个时间序列分段均值的标准差。具体来说，StatAv10（将时间序列分为10个不重叠分段）与长寿命PSD95突触密度呈正相关（r = 0.52）。与此同时，SAP102突触密度与极端（异常值）事件的存在和时序相关的特征最相关，因此具有更多SAP102突触的区域往往表现出更多的高幅度事件，尤其是在时间序列的后期。SAP102突触密度与一个测量极端异常值事件中位时序的时间序列特征呈正相关（r = 0.64）。这些动态表型也延伸到了共定位突触。而对于短寿命PSD95突触，其密度与时间序列特征的一致性较差，表明短寿命PSD95突触与血流动力学的特定特征没有可靠关联。
突触类型与结构和功能枢纽共定位
具有独特动态特性的突触类型是否形成不同的宏观结构和功能连接？研究人员使用小鼠大脑中的轴突投射数据集构建了一个加权有向的结构连接矩阵。他们首先询问突触密度是否与结构加权入度（即进入单个区域的所有传入连接强度的总和）相关。由于PSD95和SAP102是在突触后表达的，它们本质上是传入连接的标记物。他们发现，尽管长寿命PSD95和SAP102突触具有不同的空间表达谱，但两者均与加权入度显著正相关。然而，只有SAP102突触——即在时间序列中标记高幅度事件的突触——与加权出度（所有传出连接强度的总和）显著相关。短寿命PSD95突触再次显示出突触密度与度之间的一致性较差。
当考虑新皮质的层特异性突触密度时，全局解剖连接性也与SAP102突触密度相关，而与PSD95突触密度无关。通过将加权入度和出度与层特异性突触密度相关联，他们发现只有层特异性SAP102突触密度与结构度显著相关。具体来说，第IV层（传入连接的主要接收层）的SAP102突触密度与加权入度显著相关，而第II/III层（皮层-皮层传出连接的主要来源层）的SAP102突触密度与加权出度显著相关。此外，他们发现PSD95突触密度与结构度的相关性与突触寿命密切相关：寿命较长的突触与结构入度和出度的正相关性更强。
接下来，他们比较了突触密度与功能连接性（区域fMRI时间序列之间的成对相关性）。具体来说，他们将突触密度与功能连接的区域加权度（一种功能整合的度量，定义为一个区域与所有其他区域之间的功能连接强度之和）相关联。他们发现短寿命PSD95突触不相关，SAP102突触弱相关。另一方面，长寿命PSD95突触密度与功能加权度在皮质结构内呈强负相关。换句话说，具有较少（但非零）长寿命PSD95突触（以及更平稳信号）的区域往往是功能枢纽。确实，具有许多长寿命PSD95突触（以及更不平稳信号）的区域位于功能专门化区域，如视觉、体感和听觉皮层。当他们单独考虑11种PSD95亚型时，他们发现所有长寿命PSD95突触与功能加权度的相关性均小于-0.5，而短寿命PSD95突触的相关系数范围从-0.52到-0.14。这些发现共同证明了长寿命PSD95和SAP102突触之间的二分法：PSD95突触可能对区域功能专门化很重要，而SAP102突触可能参与建立大脑中稳定的连接结构。
突触类型介导结构-功能关系
鉴于结构和功能组织反映了突触结构，研究人员接下来询问突触类型是否介导大脑结构和功能之间的耦合。他们将区域结构-功能耦合定义为一个简单线性回归模型的拟合优度（R2adj），该模型根据一个区域的结构连接谱预测其功能连接谱。为了绕过结构连接矩阵稀疏的限制，他们计算了结构连接组的可沟通性，从而得到一个描述信息如何轻松从一个区域扩散到另一个区域的完整矩阵。接下来，他们将长寿命PSD95、短寿命PSD95或SAP102突触密度添加到回归模型中，并比较模型拟合度的变化。
到目前为止，短寿命PSD95突触始终表现出与宏观血流动力学特征、解剖连接性和功能连接性的弱相关性或无相关性。这些突触可能包含蛋白质回收率过快，无法建立可测量的长期动态或连接。他们假设，与长寿命PSD95和SAP102突触相比，这些短寿命PSD95突触可能更与清醒状态与麻醉状态下所需的认知灵活性相关。因此，他们将分析扩展到一个在氟烷麻醉下获取的小鼠fMRI记录数据集。他们询问：短寿命PSD95突触密度是否只在小鼠清醒时改善结构-功能耦合？
具体来说，他们使用源自麻醉小鼠的功能连接矩阵重新计算了添加三种突触类型前后的结构-功能耦合。然后，他们比较了在清醒小鼠与麻醉小鼠中，添加突触类型如何改变区域ΔR2adj的分布。对于长寿命PSD95和SAP102突触，结构-功能耦合的增加在麻醉与清醒小鼠之间没有显著差异。另一方面，短寿命PSD95突触在麻醉小鼠中表现出显著降低的ΔR2adj，即短寿命PSD95突触密度信息在清醒小鼠中比在麻醉小鼠中显著更多地改善了结构-功能耦合。为了确保在不同麻醉剂下的普适性，他们使用另一组用美托咪定和异氟烷组合麻醉的小鼠数据集复制了这些发现。短寿命PSD95突触再次显著增加了清醒小鼠的结构-功能耦合。
敏感性和稳健性分析
研究人员进行了六项分析以评估当前发现的敏感性和稳健性：
- 1.
与基因表达数据的关联：他们证实突触密度数据与来自更大群体小鼠的突触相关基因表达数据共表达。尽管长寿命PSD95和SAP102突触在很大程度上遵循独立的表达模式，但三者均与涉及突触组织、可塑性和发育的基因共表达程度最高。
- 2.
排除fMRI信噪比影响：他们确保突触密度与动力学的关系不是由fMRI信噪比（SNR）驱动的。在从与SNR显著相关的2,454个时间序列特征中回归掉SNR的影响后，长寿命PSD95和SAP102突触的动态表型仍然可重复。
- 3.
排除运动伪影影响：他们确保fMRI信号幅度和时间序列特征不是由运动驱动的。分析表明，信号幅度与帧间位移（FD）之间的相关性很小，且与突触密度无显著关联模式。
- 4.
全局信号回归稳健性：他们确保突触密度与动力学的关系对全局信号回归（GSR）不变。在应用GSR后重新计算的时间序列表型与原始表型高度相关，且突触相关的时间序列谱高度一致。
- 5.
时间序列特征可重复性：他们通过比较个体小鼠表型与群体平均表型来评估时间序列特征的可重复性。所有个体时间序列表型与平均时间序列表型正相关，且个体与群体时间序列空间分布的经验平均相关系数为0.43。
- 6.
排除细胞类型共定位影响：他们测试了突触类型与时间序列特征关系的特异性。虽然长寿命PSD95突触与小胶质细胞密度显著相关，SAP102突触与神经元和兴奋性神经元密度显著相关，但这些细胞类型密度仅与少数时间序列特征相关，且关联性很弱。因此，他们得出结论，所报告的突触类型与区域动力学之间的关联并非由特定细胞的空间定位驱动。
讨论
本研究发现了不同性质的神经活动可以追溯到特定突触类型的表达。因此，大脑区域的突触组成不仅与其宏观动力学相关，还影响其在整个大脑结构和功能网络中的嵌入。突触寿命成为突触的一个重要特性，长寿命突触倾向于与大脑连接性相关，而短寿命突触则参与清醒状态下的功能处理。总的来说，这项工作在描述突触对全脑动力学和连接性的影响方面架起了微观尺度和宏观尺度之间的桥梁。
本报告是理解不同突触如何塑造大脑功能的更广泛努力的一部分。尽管传统上认为突触属于三类之一（兴奋性、抑制性、调节性），但质谱和免疫印迹实验揭示了突触蛋白和突触功能的巨大多样性。本文重点研究了两种兴奋性突触：表达PSD95的和表达SAP102的。这两种蛋白质在整个大脑中差异表达，并对突触产生不同的影响。虽然单个突触类型的结构和功能已有描述，但它们的宏观影响尚不明确。本文解决的基本问题是：大脑区域的突触组成是否与其功能动力学相关？
有丰富的文献旨在理解神经动力学的分子和细胞起源。先前的研究报告称，神经振荡可能源于特定的细胞类型、局部基因转录或神经递质受体。然而，这些发现仅基于少数时间序列特征。为了解决这一局限性，新的特征工程方法被开发出来，以便全面总结活动时间过程的统计特征。使用这种方法，最近的研究表明，神经动力学的不同性质可以追溯到大脑组织的特定元素，包括解剖连接、细胞类型分布和髓鞘形成，尽管这些大脑组织层如何调节动力学仍不清楚。
一个被忽视但引人注目的可能调节区域活动的分子特征是突触。本文比较了区域动态表型与不同突触的潜在表达，发现每种突触类型都与大脑活动的特定特征相关。在单突触水平进行的药理学实验已经证实，突触类型与不同的兴奋性突触后电位相关。因此，宏观动力学模式是突触特异性兴奋性突触后电位总和的结果。他们发现PSD95突触在具有非平稳动力学的区域中富集，而SAP102突触在动力学以高幅度事件为标志的区域中富集。这表明SAP102突触被调谐到导致活动爆发的重合输入刺激，而PSD95突触对广泛的输入有反应，导致更多变的兴奋性突触后电位、发放率和宏观神经动力学。这一发现与单突触药理学实验的报告一致，表明PSD95突触参与突触增强，而不论输入刺激频率如何，而SAP102突触在调节可塑性方面具有频率特异性。总之，这支持了这样一种观点，即具有重叠分布的异质突触类型，每种类型与特定的神经元反应特性相关，可能会组合起来编码不同类型的区域间信号传导，并产生独特的时空动力学。
本报告将局部突触形态与区域血流动力学的统计特性联系起来，但并未通过实验解决中间步骤。鉴于所报告的发现源自fMRI，而fMRI不仅受神经元活动影响，还受血管系统影响，阐明突触-动力学关系的神经元成分仍然是一个重要目标。因此，这项工作将受益于旨在理解突触组合如何产生独特神经元群体动力学的多尺度实验。例如，将单突触药理学实验扩展到具有受控突触组成的神经元群体，将有助于建立单个兴奋性突触后电位如何在一个神经元群体上求和以产生群体动力学。同样，用其他更直接的神经活动测量方法（例如小鼠的钙成像，或人类的脑磁图/脑电图）复制这项研究，将确定所报告的时间序列特征关联是否可以推广到其他具有各自生物学解释的成像和记录技术。这项工作还将通过对突触密度与区域血流变化之间关系的更深入理解，或更广泛地说，对神经血管耦合的理解，来补充，以便建立突触-动力学关系的神经元特异性。例如，使用脑血流的时变测量进行复制分析将揭示突触密度是否与血流动力学信号独特相关，或者突触密度是否与区域血流的变异性类似相关。虽然神经元活动与血管变异性之间的关系不是本手稿的重点，但他们指出，在不考虑神经血管耦合的情况下解释突触-血流动力学关系是不完整的。他们希望这一发现将启动对区域突触组成与群体动力学之间关系的更深入探索。
如果突触结构调节区域动力学，那么突触结构如何影响大脑区域在全局结构和功能网络中的嵌入和参与呢？他们发现SAP102和PSD95突触对全局网络拓扑结构做出相反的贡献。SAP102突触存在于形成许多传出结构连接的区域，而PSD95突触密度与功能枢纽相关。此外，结构和功能枢纽的布局特别反映了稳定表达PSD95数天、数周或数月的突触的存在。这些发现有助于越来越多的文献，这些文献强调了用微观分子信息丰富宏观大脑网络在揭示关于大脑组织的新见解方面的前景。例如，先前的研究报告称，全脑网络组织可以映射到基因表达模式、蛋白质丰度、细胞类型分布以及不同类型的振荡动力学。突触结构填补了这些其他描述层之间的空白，从而有助于更全面地理解多尺度大脑组织以及大脑结构和功能之间的关系。
为什么有些突触表达寿命长的蛋白质，而另一些则表达寿命短的蛋白质？一般来说，蛋白质周转是维持细胞健康和根据特定环境调整蛋白质水平的重要过程。实际上，突触中的蛋白质周转控制着突触可塑性，并可能是记忆的分子标记，因此表达长寿命蛋白质的突触“保持”适应性，而具有短寿命蛋白质的突触则迅速重置。特别是，PSD95寿命已被证明在新皮质的浅层（长期记忆存储的地方）最长，并随着年龄增长而增加，可能反映了成年后期长期记忆存储的增加。与此同时，短寿命PSD95突触在延髓中表达最多，并且在早期发育期间。长寿命PSD95突触在新皮质和短寿命PSD95突触在脑干的定位使得研究人员推测，长寿命突触蛋白更多地参与高级认知功能，而短寿命突触则与先天行为相关。然而，他们发现，无论小鼠是清醒还是麻醉，长寿命PSD95突触似乎都扮演着相似的角色，而短寿命PSD95突触仅在小鼠清醒时改善结构-功能耦合。因此，他们假设短寿命PSD95突触参与清醒期间所需的即时认知灵活性，而长寿命PSD95和SAP102突触支持与稳态相关的更基本功能。
由许多可能的突触后蛋白组合产生的突触多样性，为突触编码的生理反应创造了庞大的储备。因此，令人困惑的是，PSD95-SAP102共定位突触似乎不是协同创造出具有独特生理和血流动力学特征的新突触类型，而是要么是仅表达PSD95的突触，要么是仅表达SAP102的突触的冗余拷贝。先前的研究表明，在缺乏SAP102突触的小鼠中，PSD95突触的分子组成被重新编程，这也许是一种补偿行为。因此，共定位突触可能提供了将突触从PSD95重新编程为SAP102，或反之亦然的分子“选项”。一方面，突触重新编程可能仅在基因突变导致突触类型受损的极端情况下才有必要。然而，也有可能共定位突触能够根据外部输入动态调整其生理反应特征。总的来说，研究共定位突触中的突触组重新编程将有助于更好地理解共定位突触的目的和功能。
将纳米级突触组图谱与宏观全脑成像相结合的一个有前景的未来研究方向是研究疾病病理学。突触病理学是影响所有年龄段个体的精神、神经和发育障碍的主要原因。数百种遗传疾病靶向特定的突触蛋白，因此靶向特定的突触类型。例如，PSD95和SAP102突触都是遗传疾病的目标，包括儿童学习障碍。通过将突触类型映射到大脑动力学和连接性，我们将更深入地了解特定突触类型的病理学如何在整个大脑中表现出来。最终，未来将突触组图谱与大脑成像相结合的研究，无论是在人类还是模型生物中，都可能增强我们对如何利用成像来监测疾病进展和治疗干预的理解。
最后，他们提出了一些方法论上的局限性。首先，他们只考虑了两种兴奋性突触类型。虽然PSD95和SAP102都是关键的突触蛋白，但突触类型的多样性才刚刚开始被充分认识和理解。需要进行广泛的研究来全面表征大脑中存在的多种突触类型的空间分布、结构和功能。其次，尽管全脑突触成像技术是最新和最先进的，但目前的全脑突触密度图仅限于单只雄性小鼠。这是一个重要的限制，阻碍了我们评估当前发现是否可以推广到更广泛的动物群体或跨性别的能力。随着突触成像技术变得更高效，研究突触结构如何影响个体特异性的结构、功能和行为将成为可能。类似地，时间序列特征计算是在10只小鼠的fMRI数据上进行的，样本量较小，且时间序列特征空间分布的个体可重复性较差。因此，他们跨小鼠平均时间序列特征以最大化信号和可重复性。此外，fMRI数据仅在雄性小鼠中获取，妨碍了对这些发现如何推广到雌性小鼠的理解。第三，突触密度、示踪和fMRI数据源自不同的小鼠群体，这凸显了对包含来自不同大脑组织尺度测量的更全面数据集的需求。此外，跨空间尺度的测量整合需要对高分辨率突触密度数据进行下采样。第四，本报告使用fMRI动力学作为神经动力学的代理，尽管已知血管对fMRI信号有贡献。因此，所报告的发现并不反映纯粹的神经元活动。
总之，他们证明了局部突触形态与区域fMRI动力学的特性稳健相关。因此，大脑区域的突触组成将影响其参与全脑结构和功能网络，以及在不同行为状态下的参与。总的来说，这项工作阐明了突触在塑造全脑组织中的根本作用。
