《PLOS Biology》：Integrated chromatin and transcriptomic profiling reveals sex-specific mechanisms of gene regulation in hepatic nutrient responses
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作为本领域的重要资源研究，本文通过整合分析（ATAC-seq和RNA-seq）构建了小鼠肝脏在不同饮食条件下的核小体可及性图谱，揭示性别是驱动染色质可及性变化的关键因素，并利用四核心基因型模型等阐明了性腺与染色体性别对饮食诱导基因调控的影响，特别是发现了睾酮通过抑制NFY染色质互作来调控性别二态性GWAS基因PNPLA3的新机制。
引言
表观遗传检查点帮助细胞协调转录本的生物合成并与基因调控的其他步骤进行相互作用。DNA通常包裹在核小体中，这些高度浓缩的结构聚集形成染色质。染色质可通过多种机制从活跃状态转变为非活跃状态。DNA或组蛋白的化学修饰可以改变染色质的三维结构和核小体的位置。由于核小体重排通常发生在转录因子（TFs）结合和激活之前，因此关于核小体位置的信息可用于推断活跃的调控区域。随着ATAC-seq的发展，对可及染色质区域的全基因组分析日益普及。尽管关于基础条件或发育过程中组织染色质状态空间组织的ATAC-seq数据集有所增加，但我们对染色体重排如何影响代谢健康和疾病状态的理解仍在进行中，并且主要局限于少数已深入研究的基因和广泛的表观遗传修饰。特别是，很少有研究仔细检查响应饮食的核小体定位中与性别相关的差异。
肝脏将饮食信号转化为影响基因表达和新陈代谢的信号。例如，高脂饮食（HFD）改变肝脏代谢以适应过量热量和高脂肪含量的摄入，而富含胆固醇的饮食也会改变肝脏代谢和RNA生物合成，但其方式与HFD不同。这两种饮食都会增加代谢相关脂肪肝病（MAFLD）的风险。MAFLD和其他代谢特征受生物性别影响。例如，基础状态和喂食富含脂质饮食后肝脏脂质组成因性别而异。已提出的肝脏基因表达和代谢性别差异的介质包括雌激素受体、生长激素、X染色体因子以及BCL6–STAT5轴。
染色质变化可为转录或参与转录本剪接、修饰和输出的通路相互作用奠定基础。然而，我们尚不清楚肝脏染色质环境响应不同挑战的程度，或者它如何促进基因表达和功能。由于选择性基因调控受到表观遗传学的强烈影响，因此绘制染色质可及性图谱可用于推断关键的转录调节因子并确定它们的协同和层级相互作用。在这项资源研究中，我们绘制了小鼠肝脏的染色质景观，并分析了饮食和性别对肝脏转录调控的影响。
结果
1. 性别调控肝脏启动子区域的染色质可及性
为了更好地理解饮食如何影响染色体重排，研究人员给雄性和雌性野生型小鼠喂食正常维持饲料（CD）、富含胆固醇的西式饮食（WD）或低胆固醇HFD两周，并通过ATAC-seq检查它们的肝脏。在所有组别测序后获得了可比的数据量，每个样本表现出相似的对齐率。在三个饮食组绘制的122，587个独特峰（指示可及染色质）中，49%位于基因间区，38%位于内含子区，7%位于“启动子-转录起始位点（TSS）”区域。主成分分析显示，喂食CD的雌性和雄性小鼠在主要成分1和2上具有大致相似的谱。主要成分1捕获了超过82%的变异。雄性小鼠对饮食的反应比雌性小鼠更具可变性，尤其是在喂食HFD时。响应WD或HFD的染色质变化因性别而异，并且WD导致主要成分1的差异更大。因此，响应富含脂质饮食的肝脏染色质可及性以高度性别偏向的方式存在差异。
大多数可及位点在响应饮食时并未显示染色质可及性的改变（组成型）；然而，雌性小鼠失去和获得可及位点的数量都多于雄性。由于WD或HFD而导致的差异可及区域（DARs）在基因间区、内含子区和启动子-TSS区域的比例很高，这些区域并未显示基因组定位上显著的性别特异性差异。然而，染色质可及性的性别诱导差异在TSS区域成比例地更加集中。与CD相比，喂食WD或HFD的雌性小鼠比喂食相同饮食的雄性小鼠拥有更多的DARs，包括启动子处可及位点的获得和丢失。因此，响应富含脂质饮食的染色体重排在雄性和雌性小鼠之间存在差异，特别是在启动子区域。
为了识别参与性别特异性染色质调控的潜在TFs，研究人员首先分析了基序富集情况，使用来自每个组（CD对比HFD或WD）每个基因组位置的前200个DARs。鉴于WD组个体变异性较低，选择WD作为后续分析的代表性条件。比较WD组与CD组前5个富集基序显示，雄性“获得”峰特异性富集PBX1和Pknox1，而雌性的“获得”峰富集来自NFY、CRE和ETS家族（Elk4和ETV4）的TFs。值得注意的是，NFY在雄性和雌性中均有富集，但富集程度因性别而异。对于“丢失”峰，雄性和雌性共享共同的前富集基序，包括来自Sp TF家族的锌指DNA结合蛋白（Sp1、Sp2和Sp5）以及KLF3，在雄性小鼠中富集程度更高。雌性“丢失”中明显富集的TFs包括PPARα和HNF4α，这两种核受体的活性已知在雄性和雌性中存在差异。因此，在响应WD喂养时，观察到特定TF基序富集存在性别偏向。
2. 基序分析揭示响应饮食的性别偏向性TF偏好
为了表征肝脏染色质可及性变化与基因表达之间的关系，研究人员首先通过RNA-seq分析了喂食WD、HFD或CD两周或四周后的肝脏转录组。与ATAC-seq结果一致，WD和HFD诱导了相似的基因表达变化模式，但转录组谱因性别和饮食而明显分离。根据UMAP分析，性别是主要影响因素。因此，首先检查了性别的全局影响，并识别出401个在雄性中表达较高的基因和250个在雌性中表达较高的基因。还通过比较HFD与CD、WD与CD以及HFD与WD评估了饮食的全局影响。与CD相比，HFD和WD都诱导了相当数量的差异表达基因（DEGs），但HFD与WD相比识别的DEGs数量相对较少，正如预期，这些与甾醇生物合成有关。接下来旨在理解染色质可及性变化如何与基因表达变化相关。由于单个DEG可能与多个可及染色质区域相关，因此根据其基因组位置将ATAC-seq峰分配给DEGs，以确定哪些区域可能参与调控这些基因。峰主要定位在内含子区、基因间区和启动子-TSS区域，大多数DEGs在不止一个基因组位置显示峰。
为了在全基因组尺度上进一步剖析导致性别特异性染色质响应高脂血症的因素，分析了WD和CD组中雄性和雌性偏向的DARs。出现了四组：第一组（雄性）和第二组（雌性）响应WD获得了染色质可及性，而第三组（雄性）和第四组（雌性）则丢失了可及性。从每组中选择前100和后100个峰进行基序分析。这些峰在HFD与CD中也表现出一致的模式。基序分析结果揭示了不同的性别偏向性基序差异。例如，Cux2特异性富集在第四组（雌性可及性“丢失”），这与报道一致，即基因组区域中Cux2的富集在雄性小鼠肝脏染色质可及性更高。雌性偏向簇也如预期显示HNF4α基序富集，与我们早期的结果和先前报告一致。“雄性获得”（第一组）和“雌性丢失”（第四组）的峰富含营养感应核受体家族成员（例如，LXRE、RXRE和PPARE）的基序，而“雌性获得”（第二组）和“雄性丢失”（第三组）的峰富含锌指蛋白家族、ETS家族和NFY（CCAAT）的基序。染色质可及性获得的前富集基序在雄性中是LXRE，在雌性中是NFY。
10(P值)。">
由于启动子区域包含最高数量的富集基序，研究人员使用与CD组相比，在两种性别中，HFD和WD组中可及性增加的前200个峰和可及性减少的后200个峰（按倍数变化（FC）排序，P值<0.05）进行了启动子特异性基序分析。有趣的是，识别的主要TFs与图3B中的基序分析基本一致，除了SP5显示出相反的富集。值得注意的是，尽管总体上检测到大量的非启动子峰，但图3B中分析的大多数峰都位于启动子区域。此外，在分析喂食WD的雄性小鼠染色质可及性的前300个峰时，LXR基序仍然富集（按FC排序，P值<0.05），支持了图3B中使用的基序分析策略的可靠性。总之，这些结果表明，在响应不同饮食时，雄性对营养感应TFs的染色体重排更敏感，而雌性则对启动子结合TFs（如NFY）的重排更敏感。
3. 性别特异性TFs的染色质可及性与由性腺或染色体因素驱动的不同转录组反应相关
性别之间的基因调控差异可能由性腺或染色体因素的变化驱动。为了更好地理解这些因素在饮食反应中的作用，首先分析了饮食挑战研究中通过RNA-seq识别的肝脏DEGs，并与ATAC-seq的DARs进行重叠。得到的DEGs随后使用四核心基因型（FCG）小鼠模型的转录组数据进行了验证。ATAC-seq结果显示，WD或HFD以相似的模式诱导或抑制基因表达。首先分析了响应WD或HFD与CD相比差异表达的约2000个基因。根据FC和P值判断，这些DEGs中约有80%表现出性别偏向表达，这与大量肝脏基因以性别偏向方式调控的证据一致。通过Metascape注释了雄性和雌性响应富含脂质饮食的DEGs功能。虽然两性间由饮食诱导的共同DEGs如预期映射到“脂质代谢”，但雄性特异性DEGs和雌性特异性DEGs富集到不同的通路。
为了探索染色质可及性变化与性别表达差异基因之间的关系，将来自雄性或雌性RNA-seq的DEGs与雌性或雄性ATAC-seq变化进行重叠。通过整合ATAC-seq对基因表达进行聚类显示，WD和HFD对基因表达具有相似的总体影响；然而，WD和HFD组的基因表达因饮食挑战持续时间而异。此外，基因表达模式使我们能够预测雄性偏向和雌性偏向基因的前富集基序。在雄性偏向基因中，雄激素受体基序在雄性中强烈富集，但在雌性中不富集。相反，在雌性偏向基因中，雌激素受体（ESR1）基序在雌性中强烈富集，但在雄性中不富集。这些结果与已知的两性肝脏基因表达的激素调控非常吻合。与ATAC-seq分析显示雄性中LXR富集明显不同，RNA-seq结果显示LXR在雄性和雌性中均有富集。因此，RNA分析证实了染色质动力学中大部分但非全部的性别偏向结果。
生物性别的两个主要决定因素是性染色体（XX/XY）和性腺（卵巢/睾丸及其分泌的激素）。为了进一步研究它们在响应富含脂质饮食的性别偏向基因表达中的作用，使用了FCG小鼠模型，该模型已被广泛用于揭示性别偏向如何源于新陈代谢和其他生理系统中的不同生物来源。在该模型中，通过将Sry基因从Y染色体重新定位到一个常染色体上，有效地将染色体性别（XX与XY）与性腺性别（睾丸与卵巢）分离开。该模型的设计产生四种基因型：XXF、XYF、XXM和XYM，允许独立评估激素和染色体影响。这种方法使我们能够确定肝脏对饮食挑战的转录和染色质反应主要是由性腺激素驱动还是由性染色体组成驱动。评估了148个性别偏向基因在FCG小鼠中表达的决定因素，这些小鼠要么保留完整性腺，要么在成年期切除性腺（GDX）并喂食HFD。这些基因中约80%也受到FCG小鼠中性别决定因素（性腺性别、染色体性别或两者）的调控。
性腺和染色体状态都影响许多性别偏向基因的表达。簇1包括GDX后表达下降的基因，而簇2包括GDX后表达增加的基因。在这些组中，许多基因受染色体性别影响，表现出明显的模式，例如XX肝脏中表达高于XY肝脏，或XY肝脏中表达高于XX肝脏。这些发现揭示了响应饮食的基因调控机制的复杂调控，受到遗传和激素性别决定因素的影响。在许多情况下，在性腺激素被GDX耗尽后，性染色体基因型的调控更为明显，这表明性染色体是减少性腺激素水平（例如，绝经后和男性更年期后）情况下饮食反应的重要决定因素。总之，发现了性别偏向特征的 overlap，表明不同饮食条件下染色质动力学的变化在功能上有助于基因表达的变化。
1.5，P<0.05）。(D和E) 雌性 (D) 和雄性 (E) 小鼠的DEGs与前200和后200个DARs（来自图3A）的维恩图。(F) 基于RNA-seq，喂食WD或HFD 2周（2W）或4周（4W）的雄性（M）和雌性（F）小鼠中，重叠基因（来自D和E）的相对表达，显示相对于相应时间点喂食CD的小鼠。(G) 研究中使用的FCG小鼠生成策略示意图（左）及其遗传特征（右）。(H) 在FCG小鼠中通过RNA-seq检测到的饮食诱导的性别偏向基因表达。">
4. 染色质结构揭示疾病相关基因性别差异的机制
为了进一步研究饮食与性别偏向基因表达之间的关系，使用严格的标准识别出25个雌性偏向DEGs和32个雄性偏向DEGs，其中许多在人类肝脏中显示出性别偏向表达。值得注意的是，编码含patatin样磷脂酶结构域的蛋白3（Pnpla3）的基因是鼠类和人类肝脏中 top 的雌性偏向DEGs之一。肝脏PNPLA3之所以令人关注，是因为该基因的变异与MAFLD风险相关。对公共RNA-seq数据集的分析也表明Pnpla3是排名靠前的雌性偏向DEG。喂食不同饮食的小鼠肝脏样本的定量PCR（qPCR）证实了Pnpla3表达的雌性偏向。值得注意的是，25个雌性偏向DEGs中有16个与公共RNA-seq数据集的重叠；Pnpla3表达在性别间差异最大。此外，通过ATAC-seq检测到的人类肝脏样本染色质可及性显示，PNPLA3启动子可及性在女性中略有但一致地增加。
Pnpla3受LXR活性影响，分析显示LXR基序在性别间差异富集，但对转录组影响甚微。为了确定LXR是否有助于肝脏Pnpla3表达的性别差异，使用了两种不同的策略。首先，通过RNA-seq评估了不同饮食条件下经典LXR靶基因的变化。除喂食WD两周的雄性小鼠中的Scd1外，LXR靶基因表达在性别间没有差异。其次，给雄性和雌性小鼠口服LXR激动剂GW3965，并通过qPCR检查基因表达。GW3965诱导了LXR靶标，但肝脏LXR基因调控在性别间没有实质性差异。总之，这些结果表明性别轻微影响一些LXR靶标，但没有主要的全局影响。然而，即使在最大LXR激活下，qPCR证实Pnpla3是雌性偏向基因。总体而言，数据表明LXR调控Pnpla3，但不是其表达性别差异的关键因素。
由于PNPLA3是MAFLD性别差异的基础，并且女性肝脏中PNPLA3的较高表达可能由ER-α驱动，因此检查了雄性和雌性肝脏中Pnpla3位点的染色质可及性。在Pnpla3启动子区域延伸到基因体内识别出一簇可及区域（红色），以及另一个上游区域（蓝色）。上游区域靠近ER结合位点，并且在性别间的调控差异极小。为了直接研究ER-α在Pnpla3表达性别偏向中的作用，使用由TBG启动子控制的腺相关病毒（AAV）在野生型雄性和雌性小鼠中表达ER-α（AAV-TBG-ESRa）或GFP（AAV-TBG-GFP）。通过免疫印迹和qPCR证实了强力过表达，这也揭示了我们先前识别的ER-α调控基因Polg1的表达增加。通过qPCR测量的Pnpla3表达在雄性或雌性中AAV-GFP和AAV-ESRa之间没有显著差异。这些结果表明雌激素可能不是观察到的Pnpla3调控性别依赖性差异的主导因素。
接下来，评估了FCG小鼠中性染色体、性腺状态以及卵巢/睾丸对Pnpla3表达的影响。卵巢基因型的表达水平高于睾丸基因型，XX染色体和XY染色体组之间没有显著差异。切除睾丸增加了Pnpla3表达，而切除卵巢没有效果。这些结果表明Pnpla3表达受睾酮抑制，而不是受卵巢激素调控。
Pnpla3启动子区域的染色质可及性在喂食不同饮食的雄性和雌性小鼠之间存在显著差异。值得注意的是，Pnpla3启动子的可及性在雄性小鼠中显著降低。使用PROMO进行分析支持了Pnpla3启动子区域周围的潜在热点是不同条件下表达差异基础的观点。有趣的是，启动子可及区域与可能控制染色质 access 的关键组蛋白标记重叠。肝脏的染色质免疫沉淀（ChIP）分析显示，在女性中H3K27ac在Pnpla3位点的结合比在男性中更强，这表明染色质状态可能与Pnpla3性别特异性表达相关。这在一定程度上得到证据支持，即肝脏特异性双敲除Ezh1和Ezh2（协调激活和抑制性组蛋白标记平衡的染色质修饰因子）减弱了Pnpla3表达的性别差异，这与先前Ezh1/2与性别偏向调控之间的联系一致。
5. 睾酮通过抑制NFY染色质相互作用抑制Pnpla3表达
NFY是一种与染色质相互作用的TF，有助于维持基因启动子处的核小体游离区域，是 top 的雌性特异性富集TFs之一。对公共ChIP数据集的分析揭示了Pnpla3启动子处一个显著的NFY结合峰。为了研究NFY对Pnpla3的潜在调控，生成了NFY KO肝细胞。ChIP-qPCR证实了在Pnpla3 WT中的结合，但在NFY-KO肝细胞中没有。此外，NFY KO导致Pnpla3表达显著降低。由于FCG模型证明了睾酮介导的Pnpla3抑制，因此假设Pnpla3启动子处的NFY染色质相互作用受睾酮调控。为了测试这一点，首先用睾酮处理WT原代肝细胞，并确认睾酮以剂量依赖性方式降低Pnpla3水平。接下来检查了睾酮对NFY染色质亲和力的影响，显示睾酮处理减少了Pnpla3启动子处的NFY结合。重要的是，睾酮处理没有显著改变NFY-KO肝细胞中的Pnpla3表达，这表明睾酮对Pnpla3的抑制作用依赖于NFY。
总之，研究结果剖析了不同性别因素对饮食诱导染色质重塑和基因表达的贡献，证明CCAAT结合蛋白与睾酮信号传导协同调控启动子可及性，并促成Pnpla3表达的性别特异性差异。
讨论
这项研究提供了关于不同饮食条件下性别间染色质动力学差异的全面信息。发现饮食组成对染色质可及性的影响相对于性别的影响而言是微小的。富含脂质的饮食导致雌性小鼠启动子区域染色质可及性增加，并伴有启动子结合因子（如三聚体复合物NFY）更强的富集，而在雄性小鼠中则导致营养感应核受体的更强结合。此外，研究发现为理解关键的性别二态性基因Pnpla3的调控提供了见解，并揭示了小鼠肝脏染色质动力学响应饮食和性别的复杂性。
整合染色质动力学和基因表达揭示了性别偏向特征的实质性重叠，并提供证据表明核小体重排影响基因表达变化。然而，并非每个富集的TF都是如此。例如，LXR依赖的染色质差异在性别间很明显，但LXR依赖的基因表达差异很小。尽管LXR结合模式或活性可能在性别间存在差异，但RNA生物合成之外的机制可能调控稳态转录本水平。例如，性别间mRNA稳定性、输出或翻译效率的差异可能是重要的贡献者。
对性别偏向基因的无监督分析突出了参与脂质代谢调控的新关键因素，并为研究人员提供了一个框架，以便利用此资源来解读感兴趣基因的调控模式。在全基因组关联研究中，PNPLA3是少数几个持续与MAFLD相关的基因之一。流行病学和分子研究表明，雌激素对PNPLA3的调控有助于老年女性MAFLD的上升，尽管绝经期间雌激素水平下降。对Pnpla3位点染色质动力学的检查证实，启动子的变化似乎是性别间差异的基础。然而，发现在小鼠中Pnpla3转录水平的性别差异不是由雌激素调控，而是由雄性性腺因子、组蛋白修饰剂和在启动子处起作用的TFs调控。研究发现并不排除雌激素信号传导在Pnpla3调控中的作用，而是表明存在多种调控因素。需要指出的是，AAV介导的ESR过表达可能无法完全复制体内雌激素的生理作用，特别是考虑到雌激素的动态变化、激素波动、物种特异性差异或与其他内分泌通路的相互作用。因此，调节人类PNPLA3表达性别差异的分子通路仍将是未来研究的主题。
这项研究有一些局限性。虽然性别是染色质反应的关键驱动因素，但饮食干扰
