丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶磷酸化DosR改变靶基因转录机制并调控结核分枝杆菌对一氧化氮应激的响应

《PLOS Genetics》：Serine/threonine protein kinase phosphorylation of DosR alters target gene transcription mechanics and regulates Mycobacterium tuberculosis response to nitric oxide stress

本文揭示了结核分枝杆菌中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶与双组分系统之间的功能性联系，聚焦于关键NO/缺氧响应系统DosRS，阐明STPKs通过磷酸化DosR抑制其DNA结合与转录激活能力，从而精细调控细菌应激反应，为理解病原菌适应性机制提供了新视角。

　　

<标题>：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶磷酸化DosR改变靶基因转录机制并调控结核分枝杆菌对一氧化氮应激的响应

<作者摘要与意义>：结核病是由结核分枝杆菌引起的全球致死率最高的传染病之一。细菌成功定植宿主的关键在于其能够感知并适应感染过程中微环境的变化，其中双组分系统和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶是两种重要的信号转导机制。尽管结核分枝杆菌拥有数量相近的STPKs和TCSs，但这两大调控系统如何协同工作以响应关键环境信号仍不清楚。本研究揭示了STPKs与TCSs之间存在广泛的相互作用。以响应一氧化氮和缺氧的关键TCS——DosRS系统为例，研究发现STPKs对纯化的DosR进行磷酸化后，会降低其与靶启动子DNA的结合能力及其激活稳态基因转录的能力。与此形成鲜明对比的是，被组氨酸激酶磷酸化激活的DosR则表现出相反的表型。更为突出的是，缺失特定STPK的结核分枝杆菌突变体在低于野生型所需的一氧化氮水平下，就表现出DosR调节子转录的增加。这阐明了STPKs对TCS响应调节蛋白的磷酸化如何起到限制和微调其激活条件的作用。这些结果支持了STPKs与TCSs之间的功能联系，并揭示了二者相互作用的潜在机制。

<具体发现>：

STPKs与TCS响应调节蛋白之间存在重叠和特异性的相互作用

研究采用分枝杆菌蛋白片段互补分析法，系统地检测了四种关键的响应调节蛋白与多种STPKs之间的相互作用。结果显示，某些STPKs与多个TCS响应调节蛋白发生相互作用，特别是DosR和PrrA与几乎相同的STPK子集存在重叠性相互作用，而与PhoP和KdpE相互作用的STPKs则范围较窄，这表明STPKs与RRs之间的相互作用既存在重叠，也具有特异性。

DosR磷酸化状态的改变影响其与靶启动子的结合亲和力

研究者聚焦于DosR系统，深入探究STPK磷酸化如何从机制上影响其功能。首先通过电泳迁移率变动分析和荧光偏振分析检测了DosR与靶基因启动子的结合。结果显示，模拟组氨酸激酶磷酸转移的乙酰磷酸处理增强了DosR与其靶基因hspX和fdxA启动子的结合。相反，在体外使用STPK PknH或PknD磷酸化DosR，会显著降低其DNA结合亲和力。当STPK磷酸化和HK磷酸转移同时存在时，DosR的DNA结合亲和力则与仅经乙酰磷酸处理的DosR相似，表明STPK的磷酸化效应在HK激活的背景下被“覆盖”。这些结果证明，在没有HK磷酸转移的情况下，STPK对DosR的磷酸化会降低DosR与其靶基因启动子的亲和力。

STPK磷酸化降低并改变了纯化DosR靶基因稳态转录率的浓度依赖性

为了直接研究STPK磷酸化对转录活性的影响，研究采用基于荧光RNA适配体的方法定量检测了STPK磷酸化对DosR介导的靶基因稳态转录率的影响。结果显示，PknH或PknD磷酸化DosR会抑制其提高靶基因fdxA稳态转录率的能力。研究者还发现，经乙酰磷酸处理的DosR激活靶基因转录存在浓度依赖性：低浓度时促进转录，达到峰值后，随着浓度进一步升高，转录率反而下降。这种“失活”反应依赖于DosR结合基序的存在。有趣的是，当纯化的DosR被PknH或PknD磷酸化后再进行乙酰磷酸处理时，尽管转录增加也被观察到，但其激活窗口变窄，转录率在较高浓度下的下降更为陡峭。

STPK PknH调控结核分枝杆菌对一氧化氮的DosR依赖性转录响应

为了验证STPK活动在生理环境中的功能相关性，研究构建了缺失pknH基因的结核分枝杆菌突变体，并检测其对一氧化氮的敏感性。研究发现，在中等浓度的一氧化氮供体存在下，缺失pknH的突变株中hspX::GFP报告基因的诱导表达显著高于野生型和回补菌株。而在一氧化氮浓度较高时，所有菌株的报告基因诱导水平相似。进一步通过qRT-PCR分析DosR依赖性和非依赖性的一氧化氮响应基因表达谱，结果显示，在中等浓度一氧化氮刺激下，缺失pknH的突变株中三个DosR调节子代表基因的诱导均显著增加，且此效应可通过回补pknH基因恢复至野生型水平。然而，对于三个不依赖于DosR调控的一氧化氮响应基因，其诱导谱在野生型和突变株之间则无差异。

<讨论与展望>：

研究结果表明，STPKs通过对TCS响应调节蛋白进行磷酸化，可作为微调调控机制，为TCS活性提供额外一层的精密调控。具体而言，PknH磷酸化DosR会降低其与DNA的结合亲和力及靶基因的转录激活，而pknH基因的缺失则导致结核分枝杆菌在较低水平的一氧化氮应激下即出现DosR调节子基因的过度诱导，这有力地支持了STPKs是除其同源组氨酸激酶之外，调控DosR的第二条轴线的观点。质谱分析发现，PknH磷酸化的DosR位点位于其晶体结构的α10螺旋上，该螺旋对于激活态DosR二聚体的形成至关重要。因此，磷酸化可能通过改变DosR构象平衡，使其不利于形成具有DNA结合能力的活性二聚体，从而解释了观察到的结合与转录活性下降。这种STPK磷酸化与HK磷酸化对RR活性产生相反效应的现象，也在其他细菌中被报道，支持了STPKs作为限制因子以确保TCS在适当时机被激活的观点。研究还展示了RNA适配体转录测定法的强大应用潜力，它能够实时、定量地分析转录动力学。值得注意的是，该方法揭示了DosR激活浓度与靶基因转录率之间的非单调关系，暗示了可能存在一种结合DosR磷酸化状态的负反馈机制，以调控细菌在持续应激下的适应反应。未来，探究STPKs自身的活性如何被环境信号调节，以及STPK磷酸化如何更广泛地影响其他TCS RRs的结构与功能，将有助于更深入地理解这些关键信号转导系统在病原菌环境适应和宿主定植中的协同作用。