双氯芬酸对海洋硅藻Phaeodactylum tricornutum的应激反应及其生物转化途径

《Environmental Pollution》：Diclofenac stress responses and biotransformation pathways in the marine diatom Phaeodactylum tricornutum

本研究采用多组学方法探究海洋硅藻Phaeodactylum tricornutum对DCF的生理效应、转录响应及生物转化途径，发现低生物浓缩因子及4’-羟基DCF等代谢物，提示CYPs及氨基酸代谢途径参与解毒过程，揭示了硅藻多样化的生物转化机制。

　　

作者列表：Leopold Alezra、Emilie Le Floch、Christine Felix、David Rosain、Elena Gomez、Frederique Courant、Eric Fouilland、Giulia Cheloni

研究机构：MARBEC、蒙彼利埃大学、法国国家科学研究中心（CNRS）、Sète、Ifremer、IRD，法国

摘要

近年来，科学界在研究浮游植物对污染物应激反应和代谢机制方面付出了巨大努力。然而，对于某些在自然环境中发挥重要作用且常用于生物技术过程的浮游植物群体（如硅藻），其生物转化途径仍知之甚少。本研究采用多组学方法，探讨了双氯芬酸（DCF）对海洋硅藻Phaeodactylum tricornutum的生理影响、转录反应及代谢过程，旨在深入了解其生物转化途径。实验结果显示，DCF对Phaeodactylum tricornutum仅有轻微的生理影响，但基因表达分析表明，在暴露过程中多种分子功能和生物过程发生了改变。转录组分析提示，这种变化可能与污染物应激及解毒代谢有关。DCF的生物浓缩因子（BCF）较低，范围在3.9至2.7 L Kg^-1之间，具体取决于暴露浓度。共检测到6种DCF代谢物，其中4’-羟基双氯芬酸是一种与细胞色素P450（CYP）酶活性相关的代谢物。间接证据表明CYP参与了生物转化过程。另外5种检测到的DCF代谢物分子量较大，这些代谢物在文献中尚未被报道，推测可能是通过氨基酸（或肽）结合途径生成的。基因本体分析显示，DCF暴露后氨基酸和肽的生物合成途径发生了调控，这暗示了有机污染物解毒反应与硅藻中氨基酸及蛋白质代谢之间的潜在关联。我们的发现为污染物解毒机制提供了新的见解，并强调了浮游植物生物转化途径的多样性。

引言

每年有数百万吨合成有机化学品被用于工业、农业和消费领域（联合国环境规划署，2019年）。这些化合物部分会进入水环境，影响水质并危害水生生物（Schwarzenbach等，2006年）。浮游植物是水生光合微生物，在水生食物链和全球养分循环中起着关键作用，同时也是二氧化碳的主要吸收者（Doney，2010年）。人为活动导致的化学污染可能对浮游植物产生严重影响。然而，浮游植物并非完全无能为力：它们能够激活某些细胞途径来应对污染物（如解毒）或减轻化学物质引起的应激（如损伤修复）。尽管关于浮游植物应对污染物应激的反应已有大量研究，但其生物转化过程仍需进一步探索。在应对有机污染物的各种反应中，生物转化对污染物的命运和迁移具有决定性影响（Hellal等，2023年）。污染物可能通过特定酶的激活而发生转化，转化产物可能储存在细胞内或释放到细胞外。

多项研究表明，某些浮游植物种类在生物技术水处理过程中具有去除药物的能力（Xiong等，2018年），并揭示了它们对药物的代谢途径及降解酶（Chu等，2024, 2022；Ding等，2018；Hu等，2025；Liakh等，2023；Peng等，2014；Stravs等，2017；Wu等，2025）。这些研究揭示了浮游植物能够转化多种有机污染物，并展示了其复杂的代谢能力。然而，现有研究主要集中在淡水蓝藻和绿藻上，而对其他浮游植物类群（如海洋硅藻）的研究仍较为有限。鉴于硅藻在沿海海洋生态系统中的生态作用及其在生物技术中的应用，这一研究空白尤为突出。

近年来，多个硅藻基因组的测序结果帮助识别了参与污染物生物转化的酶编码基因。有趣的是，硅藻拥有多个细胞色素P450（CYP）基因拷贝（Teng等，2019年），这些基因在应激反应和外源物质代谢中起重要作用（Anzenbacher和Anzenbacherová，2001年）。CYP家族成员具有高度的酶活性多样性，参与多种化学物质的生物转化（Oostenbrink等，2012年）。CYP在浮游植物污染物生物转化中的作用日益受到关注（Hu等，2025；Wu等，2025），尤其是在生物技术过程中的药物降解应用（Kariyawasam等，2024；Li等，2023；Xiong等，2018）。CYP属于一个功能多样的酶家族，参与多种与浮游植物内源代谢和应激反应相关的化合物的合成与降解（例如抗氧化色素和甾醇的生物合成，Teng等，2019年）。它们的作用可能因底物和CYP家族的不同而异（Li等，2023）。硅藻基因组中含有多个属于不同CYP家族的基因（主要是CYP51和CYP97），这些基因参与藻类的外源物质代谢（Kariyawasam等，2024；Wu等，2025）。然而，CYP在硅藻中的具体代谢机制仍有待阐明。

本研究探讨了双氯芬酸（DCF）对海洋硅藻Phaeodactylum tricornutum的生理影响、转录反应及生物转化途径。Phaeodactylum tricornutum是一种重要的硅藻模型，常用于分子机制、代谢途径和应激反应的研究（Falciatore等，2020年）。该物种符合ISO 10253:2006标准，广泛用于毒性测试。选择DCF作为研究目标，是因为其代谢产物在表层水中含量较高（约占DCF总代谢物的30%），且被认为比母体药物具有更大的环境风险（Nosek和Zhao，2024a）。了解DCF的代谢途径有助于评估其代谢物的多样性和在水环境中的命运。

研究表明，浮游植物能有效去除暴露介质中的DCF（Ben Ouada等，2019；Escapa等，2016；Hifney等，2021），并且在mg L^-1浓度范围内会引发生理效应（Bácsi等，2016；Ben Ouada等，2019；Harshkova等，2021；Majewska等，2018；Sharma等，2023）。我们推测，在高浓度下观察到的效应可能与浮游植物的解毒能力有关，而CYP在此过程中起关键作用。事实上，已有证据表明CYP参与DCF的生物转化（尤其是羟基DCF的生成，Ben Ouada等，2019；Fu等，2020，2017；Liakh等，2023；Prior等，2010）。

实验部分

藻类培养与双氯芬酸暴露实验

Phaeodactylum tricornutum（CCAP1055/18，无菌菌株，SAMS藻类和原生动物培养收集中心）在含有f/2+Si培养基（Guillard和Ryther，1962）的玻璃Erlenmeyer烧瓶中培养，培养条件为20°C、持续搅拌（120 rpm）和温暖的白光照明（50 μE），光照周期为16/8小时。CCAP1055/18菌株在指定条件下的生长曲线见补充信息（图S1）。

DCF和OH-DCF的测量

无论是否存在Phaeodactylum tricornutum细胞，培养介质中的DCF浓度在培养过程中保持稳定（图S3）。在10 mg L^-1和1.5 mg L^-1处理组中，DCF浓度随时间变化不大（图1A和图1B）。两种处理组之间的细胞内DCF含量存在显著差异（图1C），暴露于较高DCF浓度的细胞内DCF含量更高。

讨论

在10 mg L^-1浓度下，双氯芬酸抑制了Phaeodactylum tricornutum的生长25%。在较低浓度（1至1.5 mg L^-1）下，DCF对生长有促进作用（尽管统计上不显著）。类似浓度下的DCF对Parachlorella kessleri（Jiménez-Bambague等，2022）和Picocystis（Ben Ouada等，2019）的生长也有促进作用。剂量-反应生长抑制曲线不符合经典的S形曲线。

结论

本研究同时探讨了双氯芬酸暴露对Phaeodactylum tricornutum的生理影响、基因表达及生物转化途径。DCF对Phaeodactylum tricornutum仅有轻微的生理影响，但基因表达分析表明，多种分子功能和生物过程发生了改变。转录组分析提示，这种变化可能与污染物应激相关，导致营养物质和能量需求增加。

支持数据

本文的RNA测序数据已存入欧洲核苷酸档案库（ENA），项目编号为PRJEB103864。每个样本的FPKM（每千碱基百万片段数）值及相对于对照组的倍数变化数据见支持性表格S6，同时提供了样本和组别信息。差异表达基因及1.5 mg L^-1处理组与对照组相比的基因本体分析结果也包含在支持性数据中。

作者贡献声明

Leopold Alezra：研究工作、数据分析。Emilie Le Floch：资源获取、方法学设计、研究实施、数据管理。Christine Felix：资源获取、方法学设计、研究实施。David Rosain：方法学设计。Giulia Cheloni：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、结果验证、项目监督、资源协调、方法学设计、研究实施、资金申请、数据分析、概念构建。Frederique Courant：撰写、审稿与编辑。

资金来源

本研究由PHYCOCYP项目资助，该项目获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划（Marie Sklodowska-Curie资助协议编号101030396）的支持。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢蒙彼利埃代谢组学与代谢分析联盟（MAMMA）的非靶向环境代谢组学平台（PONTEM）提供的支持。作者感谢Christophe Leboulanger在科学讨论和手稿校对方面的帮助。Giulia Cheloni感谢Macrogen EUROPE测序平台在RNAseq分析中的技术支持，以及Antonio Frandi在生物信息学分析方面的协助。