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抗MSRV病毒作用及机制研究：评估天然化合物myrcene对大型口 bass MSRV感染的体外及体内疗效，发现其能显著降低病毒载量并提高存活率，通过破坏病毒包膜、干扰吸附入侵及复制阶段，同时调节CAT、Nrf2、SOD、IL-1β、IL-8和TNF-α等免疫因子。
刘正昭|黄琳|于杰英|余青|刘明珠|高彦霞|秦向谋|赖俊祥|费玲|常彦雷|韩书宇|贾彩|李鹏飞
中国广东省海洋大学渔业学院，广东省本土珍贵鱼类繁殖调控与育种工程技术研究中心，广东省水生动物疾病控制与健康养殖重点实验室，湛江
摘要
Micropterus salmoides弹状病毒（MSRV）是一种高度致病性的病原体，对大口黑鲈鱼造成重大经济损失。Myrcene是一种天然的单萜类有机化合物，主要从Lindera aggregata（Sims）Kosterm中提取，这种植物在传统中药中广泛应用。本研究系统评估了myrcene对MSRV感染的体外和体内治疗效果，并全面探讨了其抗MSRV作用的机制。结果表明，myrcene在特定浓度下具有显著的抗病毒活性，能够提高感染MSRV的大口黑鲈鱼的存活率并降低组织中的病毒载量。其抗病毒效果可能归因于其通过破坏MSRV包膜、干扰病毒吸附、侵入和复制过程以及调节免疫因子CAT、Nrf2、SOD、IL-1β、IL-8和TNF-α来降低病毒传染性的能力。这些结果表明，myrcene有潜力成为有效的抗MSRV候选药物，为开发高效安全的抗MSRV渔药提供了理论基础。
引言
全球水资源的供需紧张局势日益加剧，同时海洋保护的压力也在增加。在这种背景下，水产养殖已成为一个战略性产业（Lu等人，2022年）。它对于确保粮食安全和保护海洋生物多样性至关重要。联合国粮食及农业组织（FAO）在其最新的《粮食展望》报告中预测，到2025年全球海产品产量将增加1.7%，达到1.97亿吨，比2024年增加约330万吨。其中，水产养殖仍然是产业增长的主要动力。预计2025年水产品的全球贸易量将增长2.1%，总出口值将增加5%，达到1933亿美元，贸易量约为7030万吨（Ta?bozan等人，2023年）。作为世界上最大的水产养殖生产国，中国不仅拥有无与伦比的生产规模，还拥有丰富的物种多样性。大口黑鲈鱼是中国乃至全球淡水渔业中具有经济价值的物种之一，因其生长速度快、适应性强且肉质鲜美。其养殖优势在于能够有效利用复合饲料、成熟的繁殖技术以及较高的市场价值，使得大口黑鲈鱼的养殖从区域特色产业迅速发展成为全国性的支柱性淡水养殖物种（Tacon，2023年）。
Micropterus salmoides弹状病毒（MSRV）是大口黑鲈鱼的主要病原体，会导致高死亡率并给养殖的大口黑鲈鱼带来严重经济损失，尤其是幼鱼（Lu等人，2023年）。感染MSRV后，鱼会出现运动障碍、皮肤充血以及肝脏和脾脏等器官肿大和坏死等典型病变（Yang等人，2021年）。目前预防和控制MSRV的策略包括通过饲料补充免疫增强剂。例如，游离核苷酸和黄芪多糖等化合物已被证明可以抑制关键病毒基因（如核蛋白（N）和基质蛋白（M）基因）的复制，从而将大口黑鲈鱼的存活率提高约25%至28%（Lei等人，2024年）。构建含有MSRV糖蛋白的DNA疫苗（pcDNA3.1-G）可以在接种后显著提高血清抗体水平、非特异性免疫酶活性以及IgM、IL-8、IL-12p40和CD40等免疫基因的表达，最高保护率可达48.5%（Yang等人，2022年）。另一项研究发现，某些大口黑鲈鱼品系在感染后能更早启动干扰素（IFN-γ、IRF3、IRE1）和促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β）信号通路，这种早期免疫激活与病毒载量减少和死亡率降低有关（He等人，2022年）。疫苗的优势在于生产成本低、储存和运输方便，但缺点包括潜在的口服耐受性问题、纯化难度高以及可能的过敏风险（Azegami等人，2015年）。此外，传统疫苗在安全性、副作用和对病毒突变反应方面存在局限性。因此，从药用植物中提取抗病毒活性成分的研究具有重要意义，旨在发现新的抗病毒药物或治疗策略，以弥补现有疫苗的不足，并应对病毒多样性和药物抗性的挑战（Gupta等人，2019年）。
药用植物化合物提供了一种独特的多靶点策略来对抗水生动物病毒，因为它们可以直接抑制病毒复制，同时调节宿主的免疫反应——所有这些都在生态安全的前提下进行。代表性研究表明，木兰提取物中的木兰醇和霍诺基醇可以显著增强草鱼肾细胞对草鱼呼肠孤病毒（GCRV）的免疫反应，降低病毒载量并提高存活率（Zhu，2020年）。Prunella vulgaris中的熊果酸可以促进虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）中干扰素等免疫因子的表达，从而减少传染性造血坏死病毒（IHNV）的感染程度（Li等人，2019年）。此外，Celosia cristata和Raphanus sativus根提取物的组合可以通过诱导Mx和ISG15等先天免疫基因的表达来显著抑制病毒性出血性败血症病毒（VHSV）（Park等人，2017年）。这些成就验证了药用植物中多种成分协同作用在克服单一靶点抗病毒药物耐药性风险方面的科学价值。近年来，利用植物活性成分预防和控制水生动物病毒的研究逐渐受到关注。上述进展表明，药用植物活性成分（天然产物）在水生病毒领域具有广泛的应用前景。
Myrcene是一种广泛存在于柠檬草、啤酒花和芒果等植物中的单萜类化合物，具有抗炎、镇痛、抗氧化和抗突变等多种生物活性。在抗病毒活性方面，myrcene已被证明对多种病毒具有抑制作用。Quispe Bravo等人在Vero 76细胞上的实验表明，lippia alba精油在8.02-20.88 μg/mL浓度下可将寨卡病毒斑块数量减少约59%-86%，其主要单萜成分myrcene被认为是抗病毒效果的潜在贡献者（Quispe-Bravo等人，2020年）。myrcene对抗病毒感染的机制主要涉及干扰病毒侵入宿主细胞后的复制过程，并通过诱导氧化应激和细胞凋亡来抑制病毒增殖（Bai和Tang，2020年）。迄今为止，尚无研究系统探讨myrcene在水生动物病毒感染中的作用。因此，其在水产养殖中作为抗病毒剂的潜力尚未得到充分探索。基于此，本研究在体外和体内条件下研究了myrcene对MSRV感染的作用，并探讨了myrcene的作用机制，旨在筛选针对MSRV的候选天然产物，为开发安全、环保且高效的水生动物病毒防治剂提供理论基础。
细胞、药物、病毒株和鱼类
Fathead minnow肌肉（FHM）细胞由中国广州岭南现代农业实验室的秦启伟教授提供。FHM细胞在含有10% FBS（Gibco，美国纽约州Grand Island）的L-15培养基中于28°C条件下培养。健康的成年大口黑鲈鱼（体长约4.12 ± 0.16厘米，体重约2.62 ± 0.27克）购自中国广州市花都区的一个养殖场。经过一周的适应期后，将细胞置于充氧的鱼缸中，水温为28°C。
确定FHM细胞中myrcene的安全使用浓度
光学显微镜观察显示，myrcene浓度大于0.25 mg/mL时会导致细胞出现显著的细胞病变（CPE）。CCK-8检测结果也证实，myrcene浓度大于0.25 mg/mL会显著降低细胞活力，而myrcene浓度小于或等于0.25 mg/mL则不会降低细胞存活率（图1 A）。此外，与对照组相比，myrcene...
讨论
MSRV是一种单链负链RNA病毒，具有典型的子弹形状结构，对大口黑鲈鱼养殖业造成严重经济损失。该病毒主要危害2-5厘米长的幼鱼，传播速度快，一周内的死亡率超过90%。疫情的爆发导致幼鱼养殖的存活率降至20%以下，成为限制该产业大规模发展的关键瓶颈（Baggieri等人，2023年）。
未引用的参考文献
Borges等人，2024年；Lu等人，2022年；Wolf等人，2010年；Ning等人，2024年；Rajasekaran等人，2013年。
伦理批准
涉及鱼类的实验遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告指南）进行，并获得了中国南宁市广西科学院伦理委员会的批准。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（U24A20464）、广西自然科学基金（2024GXNSFFA010017）、广西科技计划（GUIKEFA[2024]102-2）、来宾科技计划（Laikechan 241519）以及广东海洋大学研究生教育创新项目（202422）的资助。
