《Food Bioscience》：Lactic Acid Bacteria Diversity in Traditional Fermented Dairy Products: Seasonal Influences and Microbial Interactions
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丹麦传统发酵乳制品中乳酸菌群落结构及影响因素研究。采用PacBio测序Ⅱ技术与LAB特异性引物，分析59份来自丹麦四个地区、不同季节和奶源的发酵乳制品中50种LAB的组成。发现采样季节对乳酸菌多样性和群落结构影响显著，并揭示链球菌 thermophilus、乳杆菌 delbrueckii 等物种间存在正微生物互作。本研究为乳制品开发提供菌群资源保护与工艺优化依据。
赵杰|焦阳波|杜平|王丹|李宇|苏欣|郑帅莉|周亮|谢家琦|于杰
教育部乳品生物技术与工程重点实验室，内蒙古农业大学，内蒙古呼和浩特市，010018，中国
摘要
乳酸菌（LAB）在农业、食品工业和人类健康领域具有广泛的应用潜力。在本研究中，我们使用PacBio Sequel II测序技术结合乳酸菌特异性引物，鉴定了来自丹麦的天然发酵乳制品中的乳酸菌组成，并探讨了影响乳酸菌群落结构的因素。结果表明，使用乳酸菌特异性引物检测到了50种乳酸菌，包括那些相对丰度较低的物种。Lactococcus lactis是丹麦传统发酵乳中最主要的物种。与采样地点和乳源类型相比，采样季节是对丹麦传统乳中乳酸菌多样性和组成影响最大的因素。此外，我们观察到Streptococcus thermophilus、Lactobacillus delbrueckii、Lactobacillus helveticus和Limosilactobacillus fermentum之间存在积极的微生物相互作用。这些发现为乳酸菌资源及其在乳品工业中的混合发酵剂的应用提供了宝贵的见解。
引言
发酵乳制品是蛋白质、矿物质、维生素、有机酸和抗菌化合物等必需营养素的重要来源（Marco & Golomb, 2016; Tremblay, Angelo, Panahi, & Shirin., 2017）。先前的研究表明，参与发酵的微生物可以降低乳糖和其他可发酵糖的浓度，同时产生有机酸和其他抗菌物质，从而抑制腐败微生物和食源性病原体的生长（Chandan & Kilara, 2013）。流行病学研究表明，食用发酵食品与2型糖尿病、代谢综合征和心脏病的风险降低以及体重管理改善有关。这些食品中的微生物对健康益处有显著贡献（Kok & Hutkins, 2018）。因此，依赖原料乳和当地环境的本土微生物在定义传统发酵乳制品的特征方面起着关键作用（Si-Leng, Hong-Xin, Jie, Wen-Jun, & Tian-Song, 2016）。已经对传统乳制品——牦牛乳的微生物组成进行了广泛研究。利用高通量测序技术，在中国阿坝藏族自治区的发酵牦牛乳中检测到了Lactobacillus delbrueckii亚种bulgaricus、Lactobacillus helveticus、Limosilactobacillus fermentum、Lactiplantibacillus plantarum、Streptococcus thermophilus和Lactococcus lactis（Jiang, Li, Wang, Liu, & Chen, 2019）。主要在蒙古收集的库米斯样本的微生物组成也通过培养依赖方法和SMRT测序技术（PacBio）进行了分析。鉴定出的主要物种是Lactobacillus helveticus，其次是Lactobacillus kefirofaciens、Lactobacillus kefiri、Lactobacillus parakefiri和Lactobacillus diolivorans（Bai & Ji, 2017; Tang, Ma, Hou, Li, & Menghe, 2020）。尽管丹麦以乳制品丰富而闻名，但对其传统发酵乳中乳酸菌多样性的研究有限，特别是影响群落结构的因素（如季节）和微生物相互作用的研究较少。
许多方法和技术已被用于识别微生物，包括培养依赖性和培养独立性方法。虽然基于培养的方法可以有效分离有用的微生物资源，但培养方法无法完全揭示微生物群落的多样性和组成。因此，开发了微阵列、实时PCR、PCR-DGGE和16S rDNA测序等分子技术来补充或替代传统的表型鉴定方法（Mohania et al., 2008）。特别是下一代测序（NGS）和第三代测序技术的出现，彻底改变了传统发酵过程中微生物多样性的研究。诸如罗氏的454焦磷酸测序仪、Illumina、Thermo Fisher的SoliD/Ion Torrent测序仪、Pacific Biosciences SMART和Sequel II平台等众多平台，能够在一次运行中分析数百万个rDNA扩增子，实现高度详细的系统发育解析（Pereira, Neto, Maske, Lindner, & Soccol, 2020）。由27F/1492R引物扩增的通用16S rRNA基因是细菌物种水平鉴定的最常见目标（Frank, Reich, Sharma, Weisbaum, & Olsen, 2008）。16S通用引物可以通过扩增和测序揭示样本中主要细菌的组成。然而，仅使用细菌16S通用引物很难准确确定乳制品中乳酸菌的组成，尤其是低水平乳酸菌。设计用于识别乳酸菌群体的特异性引物可用于高通量测序和物种水平的分类鉴定，特别是在乳酸菌含量相对较低的复杂样本中（Qiangchuan et al., 2018）。
区域因素可以显著影响传统发酵乳制品中的优势乳酸菌物种。例如，在蒙古的传统发酵乳中，S. thermophilus和Lactobacillus helveticus是最丰富的物种，而在中国的新疆和西藏自发的发酵乳中，Lactobacillus delbrueckii亚种bulgaricus和Streptococcus thermophilus占主导地位。此外，西藏的乳制品样本中的细菌多样性远高于新疆（Si-Leng et al., 2016）。
在本研究中，我们分析了来自丹麦4个地区的59份传统发酵乳样本，涵盖了温暖季节和寒冷季节。我们的目标是通过研究（1）不同地区乳酸菌群落是否存在差异；（2）温暖季节和寒冷季节之间乳酸菌的多样性和组成是否变化；（3）有机奶和传统奶资源中的乳酸菌多样性和组成是否存在差异，来探讨不同气候条件下不同地理区域传统发酵乳中乳酸菌群落的关键影响因素。为了保护宝贵的乳酸菌资源并阐明影响丹麦传统发酵乳中乳酸菌组成的关键因素，我们采用了第三代测序技术，并使用乳酸菌特异性引物来检测低丰度乳酸菌物种。
采样方法
我们从2019年11月到2020年1月、2月以及2020年5月、6月和7月，分别从丹麦的4个行政区域收集了60份传统发酵乳样本。每个月我们获得了10份样本，其中一半来自有机奶，另一半来自传统奶。根据丹麦的季节性气候特征，这些样本被分为温暖季节和寒冷季节的样本。
测序覆盖率和生物多样性
2019年11月至2020年7月期间，我们从丹麦的四个不同地区分析了59份发酵乳样本（表S1）。本研究的主要目的是表征天然发酵乳制品中乳酸菌的结构和多样性，并确定环境、季节和微生物群特征之间的关系。从每个乳样本中提取基因组DNA，并使用乳酸菌特异性引物进行扩增，然后进行PacBio Sequel测序。
讨论
传统发酵乳制品因其原材料的固有品质和本土微生物的存在而具有很高的营养价值，并对人体具有功能性益处。其中一些具有益生菌潜力的本土微生物可以在乳品市场中进一步开发。因此，识别、分离和保存本土微生物至关重要。丹麦是世界上著名的乳制品生产国。
结论
本研究利用乳酸菌特异性引物和PacBio测序技术，对丹麦中部和南部传统发酵乳中的乳酸菌群落进行了全面分析。这种方法成功捕获了50多种乳酸菌，确认Lactococcus lactis是最丰富的物种，并鉴定出Lactobacillus kefiranofaciens、L. parabuchneri、L. hamsteri和Lacticaseibacillus casei等关键贡献者。一个重要发现是...
CRediT作者贡献声明
苏欣：可视化、资源、方法学、正式分析。
李宇：可视化、资源、方法学、正式分析。
周亮：可视化、资源、方法学、资金获取。
郑帅莉：可视化、资源、方法学、正式分析。
于杰：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理。
谢家琦：可视化、资源、方法学、正式分析。
赵杰：撰写——初稿、可视化、项目管理、正式分析。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了内蒙古自治区直属高校的基础研究资金（BR230406）和国家自然科学基金（32260573）的财政支持。
