应用旨在使蜂蜜中的产孢梭菌（Clostridium sporogenes）内孢子失活的处理方法

《Food and Bioproducts Processing》：Application of treatments aimed at inactivating Clostridium sporogenes endospores in honey

超声波联合热处理可有效灭活蜂蜜中的肉毒杆菌孢子并保持其理化特性。采用60℃加热15分钟结合超声处理，协同效应使两种蜂蜜的细菌和孢子杀灭率达最大，同时保持水分活度降低、可溶性固形物增加及电导率稳定，流变学性质未改变，证实该组合技术安全且高效。

　　

玛丽亚·塞西莉亚·埃万杰利斯塔·瓦斯康塞洛斯·希亚西 | 布鲁娜·阿泽维多·巴尔杜伊诺 | 卡琳·贡萨尔维斯·德·奥利维拉 | 泰娜·莫拉伊斯·布埃诺 | 詹妮弗·克里斯蒂娜·卡瓦略·桑托斯 | 安娜·克里斯蒂娜·弗雷塔斯·德·奥利维拉·梅拉 | 罗伯塔·希尔斯多夫·皮科利 | 阿尔西尼亚·德·莱莫斯·索萨·拉莫斯 | 贾梅·维莱拉·德·雷森德

拉夫拉斯联邦大学食品科学系，大学校区，邮政信箱3037，37200-900，拉夫拉斯，米纳斯吉拉斯州，巴西

摘要

在本研究中，我们评估了使用新兴的非热技术（超声波）、热处理及其组合对柑橘蜜（Citrus sinensis）和野生蜜中的Clostridium sporogenes的灭活效果，并探讨了可能的协同效应。目的是在保持蜂蜜的物理化学和流变特性的同时，满足食品安全标准。结果表明，超声波与热处理（60°C）结合使用15分钟（U+HT）在减少营养细胞和内孢子数量方面取得了最佳效果。物理化学分析显示，处理后的蜂蜜稳定性更高，水分活度（a_w）降低，糖度（°Brix）升高，pH值下降。电导率和羟甲基糠醛（HMF）仍处于可接受范围内，表明蜂蜜的质量得到了保持。此外，蜂蜜典型的牛顿流体行为也未发生改变。这些发现表明，超声波和热处理的联合应用是一种提高蜂蜜安全性与稳定性的有效方法，同时保留其主要品质属性。

引言

蜂蜜是由蜜蜂从花蜜中产生的过饱和糖溶液（花蜜；巴西，2000年）。其高糖浓度和酸性pH值阻止了大多数微生物的生长，只有能够耐受高碳水化合物浓度和低pH值的微生物才能存活。蜂蜜中的主要污染源包括花蜜、花粉、灰尘、空气、蜜蜂以及采后处理过程。

虽然通过良好的卫生措施可以在采后处理过程中将污染降至最低，但其他因素并不完全可控，在特定条件下可能对人类健康构成风险（Omafuvbe & Akanbi，2009年）。

获得安全、高质量的蜂蜜是市场的需求，也是养蜂业竞争力的关键因素。与蜂蜜销售相关的主要安全问题之一是其容易被细菌和真菌内孢子污染，例如Clostridium botulinum，这种细菌在环境中普遍存在，可能会影响生蜂蜜的消费。

Clostridium botulinum是一种革兰氏阳性、杆状、专性厌氧、产孢细菌，能产生肉毒杆菌神经毒素（BoNT），这是导致人类和动物肉毒杆菌中毒的病原体。据估计，全球有高达15%的蜂蜜受到C. botulinum内孢子的污染（Cabral & Oliveira，2021年）。

为了控制生物危害，人们采用了多种物理（如热处理、红外线、超声波）、化学和生物处理方法，其中热处理是最常用的方法。由于C.botulinum内孢子对环境条件具有高度抗性，化学和生物处理往往效果不佳，因此物理处理成为更合适的选择（国家社会保障管理局 - ANSES，2021年；Munir & Federighi，2020年）。由于Clostridium botulinum的强毒性（热抗性 - D₁₂₁ °C 0.1-0.2分钟），许多研究使用与其基因相关的革兰氏阳性、厌氧、产孢物种Clostridium sporogenes（热抗性 - D₁₂₁ °C 1.2-2.5分钟）进行实验。该物种缺乏编码BoNT的基因，从而确保了实验的安全性。因此，它被广泛用作Clostridium botulinum的替代品，用于验证食品的热处理过程，因为C. sporogenes产生的内孢子具有更高的热抗性且不产生神经毒素基因（Brown et al., 2012年；Janganan et al., 2016年；Butler et al., 2017年）。

热处理是通过特定的时间和温度组合施加热量来灭活食品中的微生物和酶（Fellows，2018年）。目的是获得无微生物风险的产品，同时尽量减少对感官和营养特性的影响（Black & Barach，2015年）。尽管热处理仍是主要的微生物控制方法，但其与非热技术的结合有助于保持营养和感官特性，提升食品安全性，并在蜂蜜加工过程中产生额外的效果（Munir et al., 2023年；Scepankova et al., 2021年）。

一种方法是使用超声波，这是一种新兴的非热技术，用于改进食品加工过程，以获得更安全、更高质量的产品（Dolas et al., 2019年；Astráin-Redín et al., 2020年）。需要注意的是，革兰氏阳性细菌（如C.botulinum）对超声波的杀菌效果比革兰氏阴性细菌更具抵抗力（Astráin-Redín et al., 2020年）。这种增强的抵抗力强调了将超声波与其他方法结合使用的必要性，以获得理想的效果。分析和理解每种技术的具体作用机制有助于开发和实施策略，利用它们的累积或协同效应来控制食品（如蜂蜜）中的C.botulinum（Maier et al., 2018年；Munir et al., 2023年）。

工业规模的蜂蜜热处理可以使用板式换热器进行，通过控制产品流速来调节停留时间，确保蜂蜜在所需时间内保持适当温度，从而实现微生物稳定化，而不会过度降解其品质（Zarei et al., 2019年；Subramanian et al., 2007年）。蜂蜜也可以通过连续或循环模式用超声波处理，使用探针或流动池，以确保均匀暴露。此外，当与加热结合使用时，这种处理可以减少微生物负荷，而不会显著降解酶或感官化合物（Deora et al., 2013年）。

超声波和热处理之间的协同效应源于空化作用引起的物理和化学机制的结合：气泡破裂产生微射流、冲击波和局部热峰，增加了核心的渗透性和水合程度，并生成活性自由基，这些因素共同削弱了孢子的防护层，使核心对热更敏感。这些互补作用解释了为什么热处理与超声波结合使用通常比单独处理具有更高的灭活效率；然而，其效果很大程度上取决于超声波参数和食品的特性（Taha et al., 2024年；Lin et al., 2022年；Abdulstar et al., 2023年）。

因此，本研究的目的是评估新兴非热技术（超声波）和热处理的单独应用及其组合应用（以评估可能的协同效应），用于灭活Clostridium sporogenes内孢子。选择Clostridium sporogenes作为模型生物，是因为其致病性，研究其在柑橘蜜（Citrus sinensis）和野生蜜中的灭活效果。目标是在保持产品物理化学、流变和感官特性的同时，满足食品安全标准。

样本片段

蜂蜜样本

不同类型的蜂蜜可能需要不同的加工条件来保持其品质。为此，本研究使用了来自巴西米纳斯吉拉斯州圣洛伦索的一个养蜂场的柑橘蜜（Citrus sinensis）和野生蜜。

选择这些类型是基于它们在花源和粘度上的差异，正如之前的研究中所报告的（Schiassi et al., 2021年）。柑橘蜜是单花蜜，其粘度在所有分析的蜂蜜中最高。

微生物分析

柑橘蜜和野生蜜的微生物分析结果见表2。

热处理导致两种蜂蜜的微生物数量存在显著差异（p<0.05）。在柑橘蜜中，经过25分钟热处理（HT25: 3.47 Log CFU/g）的样本中观察到了最高的营养细胞数量。热处理样本（HT15: 2.85 Log CFU/g 和 HT25: 2.92 Log CFU/g）以及对照样本（2.74 Log CFU/g）的内孢子数量也有所增加

结论

热处理单独使用或与超声波结合使用，显著影响了柑橘蜜和野生蜜的物理化学和微生物特性。

热处理与超声波的结合（U+HT）显示出最有希望的结果，提高了物理和化学稳定性（水分活度降低，可溶性固形物含量增加），同时减少了羟甲基糠醛的生成；电导率变化较小；流动行为稳定

CRediT作者贡献声明

安娜·克里斯蒂娜·弗雷塔斯·德·奥利维拉·梅拉：撰写——初稿、软件、方法论、正式分析。罗伯塔·希尔斯多夫·皮科利：撰写——审稿与编辑、验证、项目管理。詹妮弗·克里斯蒂娜·卡瓦略·桑托斯：验证、软件、方法论、正式分析。玛丽亚·塞西莉亚·埃万杰利斯塔·瓦斯康塞洛斯·希亚西：撰写——初稿、资源、方法论、研究、正式分析。布鲁娜·阿泽维多·巴尔杜伊诺：撰写——审稿与编辑、方法论、研究、正式分析。

未引用参考文献

AOAC和Latimer, 2012; Mason和Lorimer, 2002; 国家社会保障管理局, 2010; ?nür等人, 2018; 世界卫生组织, 2023.

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

数据可用性

数据将按请求提供。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

伦理声明

作者声明本研究未涉及任何人类或动物实验。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢巴西巴西利亚的国家科学技术发展委员会（CNPq，授予的奖学金（项目编号：151459/2024-0），巴西利亚的高等教育人员协调委员会（CAPES），以及巴西贝洛奥里藏特的米纳斯吉拉斯研究基金会（FAPEMIG）的支持。