《Food Chemistry》：Novel antioxidant peptides identified from wheat germ protein: Structure-activity relationships, stability, and cytoprotective ability
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小麦胚芽蛋白体外消化后鉴定出6种抗氧化肽，其中YFGWPGPK、FGWPGPR和GHHWPLPP在200 μM浓度下显著降低PC12细胞ROS水平、提升抗氧化酶活性并减少MDA含量。量子化学计算和二级结构分析表明，Trp、Tyr、Phe、His等活性位点及β-折叠/β-转角结构是关键作用机制，FGWPGPR和GHHWPLPP通过结合Keap1激活Nrf2信号通路发挥抗氧化作用。
凌凡|杨晓琳|马森|张新瑞|黄继红|刘金|邢玉荣|程静静
中国河南省开封市河南大学农学院作物逆境适应与改良国家重点实验室，475004
摘要
小麦胚芽蛋白是一种潜在的天然抗氧化肽来源，但目前尚未得到充分利用。本研究旨在通过体外消化方法从小麦胚芽蛋白中鉴定并表征新的抗氧化肽。结果表明，通过结合分离技术、肽组学、计算机模拟分析和抗氧化活性评估的系统方法，共鉴定出6种肽。这些肽的抗氧化能力依赖于特定的活性位点（Trp、Tyr、Phe、His）以及富含β-折叠片和β-转角结构的空间构象。值得注意的是，YFGWPGPK、FGWPGPR和GHHWPLPP肽在200 μM浓度下对H?O?损伤的PC12细胞具有保护作用，表现为降低活性氧（ROS）水平、增强抗氧化酶活性和减少丙二醛（MDA）含量。此外，FGWPGPR和GHHWPLPP肽能够结合Keap1活性位点并激活Nrf2表达，从而调节Keap1–Nrf2信号通路。本研究扩展了小麦胚芽蛋白作为生物活性肽天然来源的潜力。
引言
自由基的有害作用与体内天然防御系统之间的失衡可能导致氧化应激，而氧化应激与多种慢性疾病（如心血管疾病、阿尔茨海默病（AD）、糖尿病和癌症）的发病和发展密切相关（Bai等人，2022；Hu等人，2024）。此外，自由基引发的氧化反应会通过降解食品的营养成分、感官特性和质地影响食品质量（Kotha等人，2022）。抗氧化剂在减轻生物系统和食品相关基质中的自由基及氧化损伤方面至关重要（Sheng等人，2023）。近年来，植物来源的抗氧化肽因其强大的抗氧化能力、高生物利用度和环境可持续性以及无毒性副作用而受到越来越多的关注（Wen等人，2020；Zhu等人，2019）。小麦胚芽是小麦磨制过程中产生的高营养副产品，含有约30%的蛋白质，是植物来源蛋白质的完整且均衡的来源（Du等人，2022）。小麦胚芽蛋白包含所有必需氨基酸，其氨基酸组成符合FAO/WHO制定的参考标准（Du等人，2022；Zhang等人，2023）。研究表明，小麦胚芽蛋白具有抑制氧化应激相关疾病发展的作用，这主要归功于其抗氧化特性（Zhang等人，2023）。先前的研究已经证实了小麦胚芽蛋白的抗氧化效果，发现它们能显著提高总抗氧化能力，增强抗氧化酶活性，并降低AD动物模型肝脏和脑组织中的丙二醛（MDA）水平（Liao等人，2023；Zheng等人，2021）。这些特性使小麦胚芽蛋白成为开发生物活性肽的理想来源。然而，关于从小麦胚芽蛋白中鉴定抗氧化肽的研究仍然有限。许多源自不同蛋白质的抗氧化肽最初以非活性形式存在，可以通过水解过程被激活。体外消化模型是一种有价值的方法，可促进蛋白质的酶促水解，生成与人体胃肠道系统中形成的肽相似的肽（Joner & Adriano，2021；Silva do Nascimento等人，2021；Vilcacundo等人，2018）。然而，目前大多数研究依赖于单一酶的水解，这限制了肽的多样性以及真正具有生物活性的肽的鉴定（Xiang等人，2023）。相比之下，从小麦胚芽蛋白中获得的抗氧化肽（这种富含天然抗氧化潜力的来源）在这一消化途径中的研究仍不充分。此外，结构-活性关系有助于预测和开发生物活性肽，并加深对其抗氧化机制的理解（Li等人，2024）。然而，目前对这些关系的研究通常仅基于氨基酸组成，很少有研究在分子水平上探讨具体的活性位点。尽管一些研究探讨了化学活性评估与细胞效应之间的联系，但很少同时评估所鉴定肽的胃肠道稳定性，而这是确保其功能活性的关键前提。同时，小麦胚芽肽的抗氧化机制尚未完全阐明。
为了系统地研究小麦胚芽蛋白中的抗氧化肽，本文进行了全面评估，包括分离与鉴定、结构-活性关系、稳定性评估以及其细胞保护作用的抗氧化机制。小麦胚芽蛋白经过体外模拟消化处理，然后通过结合多种分离技术的多步骤过程进行分离和纯化。潜在的抗氧化肽通过肽组学、计算机模拟分析和抗氧化活性评估进行了表征和筛选。进一步通过量子化学计算和二级结构分析研究了这些肽的结构与抗氧化活性之间的关联。此外，还通过体外模拟、细胞实验和分子对接方法评估了所鉴定肽的抗消化稳定性和抗氧化机制。本研究提出了一种有效的筛选策略，用于高效鉴定生物活性肽并深入阐明其机制，为将小麦胚芽肽作为食品配方中的功能性成分提供了科学依据。
材料与试剂
脱脂小麦胚芽来自中国河南省鲲华生物科技有限公司。2,2′-偶氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（ABTS）、2,2′-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐（AAPH）、6-羟基-2,5,7,8-四甲基色胺-2-羧酸（Trolox）、三氟乙酸（TFA）、猪胃蛋白酶（符合USP规格P1750）、猪胰酶（≥250单位/mg，P7000）、猪胆汁提取物和谷胱甘肽（GSH）均购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。小麦胚芽肽的分离与纯化
蛋白质水解产物包含多种分子量和氨基酸的肽，因此需要有效的分离策略。超滤是一种初始的尺寸依赖性分离技术，肽的分子量对其生物特性有显著影响（Wang等人，2024）。对小麦胚芽蛋白水解产物进行超滤处理后，分离出了三个不同的肽组分。结论
本研究成功结合了体外胃肠道消化模拟、多步骤纯化和综合验证策略，有效鉴定了抗氧化肽。筛选出6种具有优异ABTS和ORAC自由基清除活性的肽（YFGWPGPK、FGWPGPR、PQLPYPQPQP、LPYPQPH、YGGGPFP、GHHWPLPP）。量子化学模拟和二级结构分析表明，这些肽的抗氧化活性与特定的氨基酸活性位点及富含β-折叠片和β-转角的结构有关。
CRediT作者贡献声明
凌凡：撰写初稿、数据分析、概念构建。杨晓琳：验证、软件应用、概念构建。马森：撰写、审稿与编辑、监督、概念构建。张新瑞：撰写、审稿与编辑、监督。黄继红：撰写、审稿与编辑、资金获取、概念构建。刘金：撰写、审稿与编辑。邢玉荣：撰写、审稿与编辑。程静静：撰写、审稿与编辑。未引用参考文献
Jiang等人，2025利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。致谢
本研究得到了“中央政府指导地方科技发展专项基金”（编号：Z20221341069、Z20231811012）、“河南省科技研发计划联合基金项目”（编号：235200810005）、“国家自然科学基金”（编号：32272249）、“河南省高校科技创新人才项目”（编号：23HASTIT033）以及“中国博士后科学基金”（编号：2023M741513）的资助。
