《Food Chemistry》：Hydroxytyrosol-loaded zein nanoparticles: A green formulation for pharma/nutraceutical applications
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羟基酪醇包封技术及zein纳米载体在功能食品中的应用研究。采用zein纳米颗粒封装羟基酪醇，解决其低水溶性和易代谢问题，纳米系统在高温及高离子强度下稳定，FT-IR显示氢键主导相互作用，模拟胃肠实验证实载体有效保护活性并维持抗氧化能力，为功能食品开发提供新策略。
阿格内塞·加利亚尔迪（Agnese Gagliardi）| 索尼娅·博纳奇（Sonia Bonacci）| 玛里亚劳拉·弗里西纳（Marialaura Frisina）| 埃莱娜·朱利亚诺（Elena Giuliano）| 莫妮卡·纳尔迪（Monica Nardi）| 多纳托·科斯科（Donato Cosco）| 安东尼奥·普罗科皮奥（Antonio Procopio）
健康科学系（Department of Health Sciences）
摘要
本研究介绍了一种环保且低成本的策略，用于保持羟基酪氨酸醇（hydroxytyrosol）的生物活性。羟基酪氨酸醇是一种酚类化合物，被提议用于功能性食品的强化，但其吸收效果较差且代谢速度较快。为了解决这些问题，研究人员将这种天然化合物封装在玉米醇蛋白（zein）纳米颗粒中，制备出了直径约为100纳米、粒径分布狭窄、具有负ζ电位且包封效率高的纳米系统。实验表明，这些纳米系统在经过巴氏杀菌处理后仍能保持稳定，并且在NaCl浓度高达100毫摩尔的溶液中也能稳定存在。傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析显示，氢键是驱动玉米醇蛋白与羟基酪氨酸醇结合的关键作用力。模拟胃肠道实验表明，这些纳米载体能够保护羟基酪氨酸醇免受降解，其抗氧化活性也得到了体外测试和ORAC测定法的证实。这些结果凸显了含有羟基酪氨酸醇的玉米醇蛋白纳米颗粒作为营养保健品应用和功能性食品强化剂的潜力。
引言
食品工业产生了大量的废弃物，这对废弃物处理和环境污染带来了挑战。为了回收、生物转化和利用这些废弃物中的有价值成分，人们开发出了创新的方法（Nardi等人，2023年）。在橄榄油提取过程中，会生成多种酚类化合物及其衍生物。研究表明，酚类化合物具有广泛的生物学作用，包括抗氧化作用（Nardi等人，2014年；Rizzo等人，2017年）、抗动脉粥样硬化作用（Marrero等人，2024年）、抑制血管紧张素转换酶的作用（Alcaide-Hidalgo等人，2020年），以及抗菌、抗炎和抗癌作用（Campolo等人，2013年；Juli等人，2019年）。特级初榨橄榄油（Virgin Olive Oil, VOO）因其理想的脂肪酸组成而备受关注，其中含有大量的单不饱和脂肪酸（MUFA），尤其是含有大量的次级酚类代谢物。这些代谢物使VOO区别于其他富含MUFA的植物油，后者不具备相同的健康益处（Harper等人，2006年；Lesage-Meessen等人，2001年）。根据“极性悖论”，食品中的酚类成分具有抗氧化作用，因为像橄榄酚类化合物这样的分子会在油-空气界面积累，从而抑制疏水性底物的氧化（Oh等人，2024年）。橄榄油中的主要酚类化合物包括油酸醇（oleacein，3,4-DHPEA-EDA）和油酸坎thal（oleocanthal，p-HPEA-EDA），它们分别是脱羧甲基榆林酸（decarboxymethyl elenolic acid）的二醛形式，分别与羟基酪氨酸醇或酪氨酸（tyrosol）结合。此外，橄榄油还含有橄榄苦苷（oleuropein）和苷元（ligstroside aglycones），如3,4-DHPEA-EA和p-HPEA-EA，以及简单的酚类醇类，如羟基酪氨酸醇（3,4-DHPEA或Htyr）和酪氨酸（p-HPEA或Tyr）（Bendini等人，2007年；Boskou，2015年）。酚类化合物的药理潜力尤为显著，无论是作为纯化化合物还是作为强化食品中的活性成分。关于VOO的健康益处，欧洲食品安全局（EFSA）确认其酚类成分能够保护低密度脂蛋白（LDL）颗粒免受氧化损伤（EFSA膳食产品小组，N.和A.，2011年；EFSA膳食产品小组，N.和A.，2012年）。当20克橄榄油至少含有5毫克羟基酪氨酸醇及其衍生物时，即可满足这一健康宣称要求，对应的酚类浓度为250毫克/升（欧盟委员会法规EC No. 432/2012）。因此，每天摄入20克橄榄油即可达到这一标准，前提是橄榄油中的羟基酪氨酸醇及其衍生物浓度达到250毫克/升（欧盟委员会法规EC No. 432/2012）。EFSA还批准将羟基酪氨酸醇作为新型食品成分使用，但禁止在3岁以下儿童、孕妇或哺乳期妇女中使用。批准的用量在鱼油和植物油中为每公斤0.215克（不包括橄榄油和橄榄果渣油），在可涂抹脂肪中为每公斤0.175克（不包括烹饪、烘焙和油炸用途）（EFSA膳食产品小组，2017年）。
羟基酪氨酸醇（Htyr）在肠道和肝脏中经历广泛的代谢过程，其肠道吸收程度取决于剂量。在肠道吸收细胞中，Htyr会被水解并转化为葡萄糖醛酸化、甲基化和硫酸化的代谢物（Miró-Casas等人，2003年；Suárez等人，2011年）。然而，由于其高亲水性，其生物利用度受到限制，可能影响其在食品中的应用效果。为了解决这一问题，微胶囊化和纳米胶囊化技术为提高Htyr进入全身循环的比例提供了有前景的方法。这些方法能够保持分子的稳定性，防止其氧化，从而增强其健康效益（Paulo & Santos，2018年）。此外，鉴于其抗氧化和抗菌特性，将Htyr封装在生物相容性基质中在食品工业中表现出优势，可以延缓脂质氧化，延长食品的保质期和稳定性（De Leonardis等人，2020年）。目前市场上有多种含有Htyr的膳食补充剂产品，例如Oleaselect?（Indena，意大利米兰）、Mycotyrosol（NutraLabs，意大利摩德纳）和Hydroxitirosol plus+（Granatum，西班牙穆尔西亚）。此外，还提出了多种载体来输送这种化合物，包括大乳液、多重乳液、脂质体以及固体脂质颗粒（Balducci等人，2018年；Chatzidaki等人，2016年；Cofrades等人，2017年；Costa等人，2020年；Yuan等人，2017年）。与这些系统相比，玉米醇蛋白纳米颗粒由于具有GRAS（Generally Recognized As Safe）认证，在功能性食品的口服应用中更具吸引力，因为这种认证支持基于蛋白质的纳米载体的监管认可（例如Abraxane，Gradishar，2006年）。此外，玉米醇蛋白纳米颗粒可以采用无毒且溶剂使用量少的方法制备，并且在胃部条件下以及肠道消化过程中能够保持稳定（Gagliardi等人，2025年）。事实上，蛋白质在pH值低于11的水环境中不溶，这可以防止活性化合物在胃肠道上部释放，从而实现目标递送（Paliwal & Palakurthi，2014年）。这是因为玉米醇蛋白相对耐受胃酸和酶的作用，而其在肠道中的酶和微生物群的作用会促进封装化合物在肠道中的释放（Bhushani等人，2017年；Penalva等人，2015年；Bisharat等人，2019年）。基于这些认识，本研究旨在开发一种可持续且成本效益高的天然玉米醇蛋白基纳米制剂，以保持酚类衍生物（如Htyr）的生物活性。具体而言，本研究探讨了温度和离子强度等食品相关因素如何影响含Htyr纳米系统的物理化学性质。通过傅里叶变换红外光谱分析了制剂内的关键相互作用。通过H?O?诱导的氧化应激对人类结肠癌细胞的影响以及ORAC测试评估了纳米封装过程在保持Htyr抗氧化活性方面的有效性。最后，评估了在模拟胃肠道条件下的Htyr体外释放情况，以证明该制剂的口服适用性。
材料
玉米醇蛋白（CAS 9010–66-6；25–40千道尔顿）、脱氧胆酸钠一水合物（SD）、猪胃黏膜提取的胃蛋白酶（≥400单位/毫克蛋白质）以及猪胰腺提取的胰酶（≥3倍USP规格）均购自Merck KGaA（德国达姆施塔特）。同一供应商提供的其他试剂包括MTT [3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物]、二甲基亚砜（DMSO，用于MTT实验）、磷酸盐缓冲盐水（PBS）片剂、两性霉素B溶液（250微克/毫升）等。
结果与讨论
在研究的第一个阶段，评估了用SD稳定的玉米醇蛋白纳米颗粒（Nps）的物理化学特性，其中以羟基酪氨酸醇（Htyr）作为模型化合物。未负载Htyr的纳米颗粒平均直径接近100纳米，粒径分布狭窄，ζ电位（ZP）约为-30毫伏。当Htyr的浓度在0.2至2毫克/毫升之间时，颗粒大小和多分散性逐渐增加。
结论
随着对具有健康促进作用的功能性食品和天然生物活性化合物需求的增加，人们深入研究了能够提高敏感分子稳定性、生物利用度和靶向释放的先进递送策略。在此背景下，本研究强调了基于玉米醇蛋白的纳米系统在封装羟基酪氨酸醇方面的适用性。羟基酪氨酸醇是一种具有强抗氧化特性的酚类化合物，但由于其高亲水性，其口服生物利用度有限。
作者贡献
A.G.、S.B.、D.C.和A.P.设计了实验，分析了数据并准备了手稿。A.G.和E.G.制备了纳米系统并评估了其物理化学特性。A.G.、S.B.、M.F.和M.N.进行了体外测试并参与了结果分析。E.G.和M.N.收集数据并提供了关键修订意见。D.C.和A.P.提供了试剂和材料。所有作者共同讨论了结果并批准了手稿的最终版本。
作者贡献声明
阿格内塞·加利亚尔迪（Agnese Gagliardi）：撰写初稿、软件开发、方法设计、实验实施、数据分析、概念化。索尼娅·博纳奇（Sonia Bonacci）：撰写与编辑、软件使用、方法设计、数据分析、概念化。玛丽亚劳拉·弗里西纳（Marialaura Frisina）：撰写与编辑、验证、软件使用、实验实施、数据分析。埃莱娜·朱利亚诺（Elena Giuliano）：撰写与编辑、软件使用、实验实施、数据分析。莫妮卡·纳尔迪（Monica Nardi）：撰写与编辑。
资助
本研究得到了意大利大学与研究部（PRIN2022_PNRR，项目编号P202242HYK_001）的支持。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。
