源自奇亚籽的抗氧化肽：优化、纯化、鉴定、分子机制分析及实验验证

《Food Chemistry》：Antioxidant peptides derived from chia seeds: optimization, purification, identification, molecular mechanism analysis and experimental validation

抗氧化肽优化及MPO抑制机制研究。采用响应面法优化奇亚籽蛋白酶解条件，筛选出风味蛋白酶为最佳酶（水解时间5.69h，温度52.34℃，pH7.38，酶底比8487.60U/g），分离获得分子量<3kDa活性肽。通过nano-HPLC-MS/MS鉴定出四肽（LSSAML、IKDPDTF、FSPSQRY、AGSNDESWCQGD），其中FSPSQRY和AGSNDESWCQGD为新型肽。分子对接与动力学模拟证实其与MPO稳定结合，体外实验显示四肽对MPO抑制率59.9%-75.8%，FSPSQRY抑制效果最佳。

　　

作者：潘傲 | 徐焕 | 张珂 | 王连 | 周慧玲 | 王林瑶 | 唐欣 | 李永新

四川大学华西公共卫生学院与华西第四医院，中国四川省成都市610041

摘要

本研究旨在优化奇亚籽中抗氧化肽的制备，并鉴定出能够有效抑制髓过氧化物酶（MPO）的肽。通过响应面法（RSM）研究发现，风味蛋白酶是最有效的酶，其最佳水解条件为：时间5.69小时、温度52.34℃、pH值7.38以及酶与底物比例（E/S）为8487.60 U/g。分离实验表明，分子量小于3 kDa的肽具有很强的抗氧化活性。通过纳高液相色谱-串联质谱（nano-HPLC-MS/MS）结合计算机模拟分析，鉴定出四种肽（LSSAML、IKDPDTF、FSPSQRY和AGSNDESWCQGD）；其中FSPSQRY和AGSNDESWCQGD是此前未报道过的新肽。分子对接和分子动力学模拟证实了这些肽与MPO的稳定结合。体外抑制实验显示，这四种肽均显著降低了MPO的活性，抑制率介于59.9%至75.8%之间，其中FSPSQRY的抑制效果最强，抑制率为75.8%。

引言

自由基是正常生理代谢的天然副产物，其水平由体内的内源性抗氧化防御系统严格调控，以维持氧化还原平衡。然而，当产生的自由基超过身体的抗氧化防御能力时，就会发生氧化应激，导致细胞和组织损伤，并促进多种慢性疾病的发展，包括炎症、癌症和动脉粥样硬化（Chandimali等人，2025年）。为了减轻过量自由基引起的氧化损伤，除了依靠身体的清除机制外，还需要外源性抗氧化剂。然而，传统的药物抗氧化剂存在局限性，且开发成本通常较高；合成抗氧化剂的广泛应用还受到安全性、化学稳定性和整体经济可行性的限制，这促使人们加速探索更安全的天然替代品（Bernardini等人，2010年；Louren?o等人，2019年；Pan等人，2020年）。世界卫生组织也强烈支持开发和使用天然抗氧化剂（Wang等人，2021年）。

来自天然蛋白质来源的生物活性肽受到了越来越多的关注（Zhao等人，2022年；Zhao等人，2022年）。这些肽通常是2-30个氨基酸残基组成的短链，通过酶促水解、微生物发酵或胃肠道消化从天然蛋白质中释放出来（Daliri等人，2017年）。这类低分子量肽容易被人体吸收，并能调节多种生理和代谢功能。抗氧化肽是生物活性肽的一个重要亚群，它们通过多种机制发挥作用。值得注意的是，它们可以直接通过捐赠氢原子或电子来清除多余的自由基，从而将活性物质转化为惰性分子，中断自由基引发的链式反应（Hu等人，2023年）。此外，抗氧化肽还可以螯合过渡金属离子（如Fe²⁺），减少它们参与生成羟基自由基的芬顿反应，从而防止金属催化的脂质过氧化（Xu等人，2024年）。这些肽通过上调超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等关键酶，增强身体的内在抗氧化防御能力，从而减轻过量活性氧引起的氧化应激（Hu等人，2023年）。这些机制的综合作用使抗氧化肽在减轻氧化应激方面具有显著优势。

奇亚籽（Salvia hispanica L.）属于唇形科植物，在食品科学领域因其丰富的营养成分而受到广泛关注（Motyka等人，2022年）。奇亚籽富含α-亚麻酸、蛋白质、膳食纤维、酚类化合物、维生素E、类胡萝卜素和多种矿物质。这些营养成分具有多种生理益处，包括抗炎作用（Balakrishnan等人，2025年；Tavera-Hernández等人，2023年）、抗肿瘤作用（Jeelani等人，2023年；Imran等人，2019年；Lim等人，2024年）、抗衰老作用（Khalifa等人，2023年；Mohamed等人，2020年；Sachi等人，2024年）、调节血脂（Agarwal等人，2023年；Fernández-Martínez等人，2019年；Pereira等人，2016年；De Abreu Silva等人，2021年）、调节血糖（Pam等人，2024年；Mihafu等人，2020年；Akku?等人，2022年；Sosa-Crespo等人，2021年）和调节血压（Grancieri等人，2019年；Saadh等人，2024年；Toscano等人，2014年；Villanueva-Lazo等人，2021年）。此外，奇亚籽中的蛋白质含有全部九种必需氨基酸，使其具有均衡的氨基酸组成（Kulczyński等人，2019年），这赋予了奇亚籽在开发高质量植物蛋白和功能性生物活性肽方面的巨大潜力。最近的研究表明，酶促水解奇亚籽蛋白可以产生具有显著抗氧化活性的肽。体外自由基清除实验表明，与未水解的对照组相比，奇亚籽蛋白的水解物对1,1-二苯基-2-吡啶基肼（DPPH）和2,2′-偶氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）自由基的清除活性显著更高（Cotabarren等人，2018年）。通常，单因素实验用于研究影响抗氧化活性的关键因素，即每次只改变一个变量，而其他变量保持不变。然而，这种方法没有考虑变量之间的潜在相互作用，可能会影响最佳抗氧化活性的获得。相比之下，响应面法（RSM）基于单因素实验的结果，同时评估多个变量及其相互作用，从而能够更全面地分析协同效应，并帮助准确确定实现预期结果的最佳条件（Rocha等人，2020年）。目前，关于从奇亚籽中提取生物活性肽的研究仍然非常有限，尚未利用RSM系统地优化酶促水解条件以提高奇亚籽肽的产量和功能活性。

分子对接是计算机辅助药物设计中的核心技术，用于模拟受体（目标蛋白）与其配体（如药物分子或生物活性肽）之间的相互作用，已成为从大型化学库中筛选活性化合物的强大工具（Zhao & Liu，2023年）。例如，Feng等人利用分子对接成功揭示了三种来自豌豆蛋白水解物的新型抗氧化肽的潜在作用机制。结果表明，这些肽可能通过结合Keap1-Nrf2相互作用位点来激活Keap1-Nrf2通路，突显了该技术在筛选天然生物活性肽方面的潜力（Feng等人，2021年）。在抗氧化肽的分子对接分析中，选择合适的靶蛋白至关重要。常用的靶蛋白包括参与氧化应激途径的蛋白质，如Keap1、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶，它们直接参与活性氧（ROS）的代谢。然而，这些靶蛋白常常受到转录调控，可能会延迟抗氧化肽的作用。此外，这些途径通常涉及复杂的调控机制，使得难以确定最有效的干预位点。髓过氧化物酶（MPO）是免疫反应和炎症过程中产生ROS的关键酶，因此是快速抗氧化干预的重要靶点。与转录调控途径不同，MPO可以更直接、独立于基因表达进行抑制，为针对氧化损伤提供了有前景的策略（He等人，2019年）。然而，作为炎症过程中产生ROS的关键促氧化酶，MPO在抗氧化肽研究中的分子靶点探索还不够充分，尤其是在奇亚籽衍生肽的背景下。

在本研究中，我们从奇亚籽中提取了抗氧化肽，并使用响应面法优化了酶促水解条件。通过分离、纯化、纳高液相色谱-串联质谱分析及生物信息学工具，鉴定出四种具有MPO抑制活性的抗氧化肽；其中两种肽是此前未报道过的新型序列。分子对接分析揭示了MPO与活性肽之间相互作用的潜在机制。分子动力学模拟进一步证实了这四种肽与MPO复合物的构象稳定性。体外抑制实验也表明，这四种肽在血清系统中均显著抑制了MPO的活性。总体而言，本研究为提高奇亚籽副产品的利用效率奠定了基础，并丰富了奇亚籽来源的生物活性肽数据库。

材料

奇亚籽购自四川省成都市的一个当地市场。胃蛋白酶（50,000 U/g）、碱性蛋白酶（20,000 U/g）、中性蛋白酶（10,000 U/g）、胰蛋白酶（25,000 U/g）、木瓜蛋白酶（80,000 U/g）和风味蛋白酶（20,000 U/g）购自上海源业生物技术有限公司。分子量截留值为3 kDa和10 kDa的超速离心滤膜购自Cobetter公司。肽含量使用Pierce?定量荧光肽测定试剂盒进行测定。

适宜蛋白酶的选定

酶促水解产物的肽含量和抗氧化活性受所用蛋白酶类型的影响很大。不同的蛋白酶对切割位点有特定的偏好，因此即使来自相同底物的肽也可能具有不同的性质和生物活性。本研究中使用了六种蛋白酶（木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶）来水解奇亚籽蛋白。

结论

本研究结果表明，奇亚籽水解物具有很强的抗氧化特性。通过响应面法优化后，风味蛋白酶被确定为在酶促水解过程中最大化抗氧化活性的最佳酶。此时，肽的最大浓度为0.476 ± 0.013 mg/ml（预测值为0.459 mg/ml），DPPH-RSA值为23.47 ± 1.6%（预测值为22.79%），FRAP值为0.805 ± 0.024 mM（预测值为0.842 mM），水解时间为5.69小时。

作者贡献声明

潘傲：撰写初稿、可视化处理、验证、方法学设计、数据分析。 徐焕：可视化处理、方法学设计、数据分析。 张珂：可视化处理、方法学设计、数据分析。 王连：资源获取、方法学设计、数据分析。 周慧玲：可视化处理、方法学设计、数据分析。 王林瑶：可视化处理、验证。 唐欣：可视化处理、方法学设计。 李永新：撰写修订稿、资源获取、项目管理、方法学设计。

未引用参考文献

Pereira da Silva等人，2016年

?zbek Akku?, ?zdemir, ?zbek, ?ncel和Yap?c? Nane，2023年

Zhou等人，2021年

利益冲突声明

作者声明没有可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家市场监督管理总局（营养与健康化学计量与应用）重点实验室开放项目（项目编号：2024ZYYKF02）的支持。