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《Food Chemistry》：Decoding volatile compound-aroma attribute correlations in representative Oolong Teas of Fujian: An integrated objective quantification and GC–MS profiling method

羟基苯甲酸结构差异影响抗氧化与细胞毒性：比较GA、GE、PR、VA的电化学性质及细胞实验，发现羟基密度决定化学抗氧化能力，但生物活性非线性，GA高抗氧化但具细胞毒性，PR和VA抑制DNA氧化损伤，验证需整合多方法评估结构-活性关系。

　　

Izabela Koss-Miko?ajczyk|Monika Kuczyńska|Klaudia Suliborska|Klaudia Tiszbein|Zuzanna Koziara|Jacek Namie?nik|Wojciech Chrzanowski|Agnieszka Bartoszek

格但斯克工业大学化学系，波兰格但斯克，80-233

摘要

羟基苯甲酸（HBAs）是一类具有公认抗氧化潜力的膳食酚类化合物，然而其化学结构与生物活性之间的关联仍不明确。本研究比较了四种羟基苯甲酸：没食子酸（GA）、 Gentisic 酸（GE）、原儿茶酸（PR）和香草酸（VA）。抗氧化效率与羟基密度相关，其中没食子酸的活性最强，而香草酸的活性最弱。在细胞抗氧化活性测定中，没食子酸再次表现出最强的效果，而原儿茶酸、Gentisic 酸和香草酸的活性较低，这反映了它们在生物利用度上的差异。没食子酸以剂量和时间依赖的方式降低了 HT29（癌细胞）和 CCD841（正常）结肠细胞的活力，而 Gentisic 酸、原儿茶酸和香草酸在浓度高达 1 mM 时基本无毒。原儿茶酸和香草酸显著减少了过氧化氢诱导的 DNA 损伤，而没食子酸和 Gentisic 酸则没有这种效果。总体而言，这些发现强调了使用互补的化学和生物学方法评估酚类化合物在细胞氧化还原平衡中的作用的重要性。

引言

羟基苯甲酸（HBAs）是一类天然酚类化合物，广泛存在于水果、蔬菜、全谷物、茶叶、咖啡和葡萄酒等食物中。在植物中，它们以游离形式存在，或与其他有机酸或糖类结合（Kumar & Goel, 2019）。与黄酮类化合物相比，酚类化合物通常具有更高的水溶性和生物利用度，这可能增强其在体内的生物活性（Middleton, Kandaswami & Theoharides, 2000）。从结构上看，羟基苯甲酸具有苯甲酸骨架，并带有羟基和/或甲氧基，这些基团的数量和位置决定了它们的氧化还原行为和生物活性（Kumar & Goel, 2019）。最常见的羟基苯甲酸包括香草酸（VA）、原儿茶酸（PR）、Gentisic 酸（GE）和没食子酸（GA）。尽管这些化合物在结构上相似，但它们表现出多样的生物活性。

香草酸（VA）是香兰素的氧化产物，含有一个对位羟基和一个间位甲氧基（图 1）。虽然其清除自由基的能力相对较弱，但它具有多种促进健康的特性，如恢复受损的氧化还原平衡（Farhoosh, Johny, Asnaashari, Molaahmadibahraseman & Sharif, 2016）。例如，香草酸可以减少巨噬细胞中的促炎细胞因子释放和一氧化氮的产生，并对糖尿病动物模型中的葡萄糖平衡和血压产生有益影响（Farhoosh, Johny, Asnaashari, Molaahmadibahraseman & Sharif, 2016; Vinothiya & Ashokkumar, 2017; Kim et al., 2011）。此外，香草酸还被证明能抑制某些与食物相关的微生物的生长（Campos et al., 2009），这表明即使是结构简单的羟基苯甲酸也可能具有多样的生物活性。

原儿茶酸（PR）在 Hibiscus sabdariffa 和其他植物来源中含量丰富，其羧基对位和间位分别有两个羟基（图 1），赋予其类似儿茶酚的特性。PR 与多种氧化还原相关活性有关，包括抑制癌细胞增殖和血管生成、调节抗氧化酶系统以及调控炎症介质如 iNOS 和 COX-2（Borate et al., 2011; Kakkar & Bais, 2014; Tanaka et al., 2011）。此外，PR 还通过改善脂质谱型和增强胰岛素刺激的葡萄糖摄取来参与代谢调节（Scazzocchio et al., 2011）。其抗菌和抗病毒活性（Chao & Yin, 2009; Zhou et al., 2007）表明 PR 可通过直接的抗氧化机制和广泛的生化相互作用影响细胞平衡。

Gentisic 酸（GE）在羧基的邻位和间位各有一个羟基（图 1），尽管研究较少，但仍显示出良好的药理潜力（Kang et al., 2021）。现有证据表明，GE 可减弱细胞共培养系统中的炎症反应和脂肪生成，抑制体内肿瘤生长，并在帕金森病模型中发挥神经保护作用（Altinoz et al., 2018; Kabra et al., 2014; Kang et al., 2021）。尽管其抗氧化潜力相对于没食子酸较弱，但这些发现表明 GE 可通过多种细胞途径发挥作用，而不仅仅是直接清除自由基。

没食子酸（GA）含有三个羟基，分别位于对位和间位，被认为是最强的天然抗氧化剂之一，常被用作抗氧化测定的参考化合物。除了强大的电子捐赠能力外，GA 还通过恢复酶促抗氧化防御和减少脂质过氧化标志物来调节细胞氧化还原系统（Giftson et al., 2010）。研究表明，GA 可抑制炎症介质，防止化学诱导的致癌作用，并在啮齿动物模型中发挥抗糖尿病作用（Gandhi et al., 2014; Pandurangan et al., 2015）。此外，GA 及其衍生物还具有抗菌和抗病毒活性（Chun et al., 2005; Ganesh et al., 2022; Modi et al., 2013），这突显了其多羟基结构的多功能性。

重要的是，越来越多的证据表明，在化学测定中观察到的强抗氧化活性并不一定转化为有益的生物效应。酚类化合物的生物学作用可能取决于其分子结构、细胞摄取、细胞内分布和氧化还原信号通路，而不仅仅是清除自由基的能力（Jakubek et al., 2024; Koss-Miko?ajczyk et al., 2019; Sies et al., 2024）。因此，内在抗氧化能力较低的化合物可能产生有利的生物结果，而高氧化还原活性的分子在特定条件下可能会引起细胞毒性或促氧化效应，这反映了氧化还原状态的转换和 hormetic 行为（Sies et al., 2024; Murakami et al., 2024; Wan et al., 2024; Farhan et al., 2024）。这些考虑强调了结合化学、电化学和基于细胞的方法进行综合结构-活性分析的必要性。

尽管许多研究探讨了单个羟基苯甲酸的生物活性，但很少有研究使用统一的实验方案系统地比较结构相关的类似物（Baranowska et al., 2018; Kakkar & Bais, 2014; Kumar & Goel, 2019）。电化学性质（如氧化电位）、清除自由基的能力与生物效应（如 DNA 保护或细胞毒性）之间的关系仍不甚清楚（Baranowska et al., 2018; Jakubek et al., 2024; Sies et al., 2024）。众所周知，羟基苯甲酸的生物活性与其化学结构密切相关，特别是羟基和甲氧基的数量和位置（Kumar & Goel, 2019）。本研究使用电化学、光谱学和基于细胞的方法全面评估了没食子酸、Gentisic 酸、香草酸和原儿茶酸的活性。标准还原电位（E₀）和抗氧化能力（AOP）分别通过电位滴定和差分脉冲伏安法（DPV）确定。使用时间分辨 DPPH 和 ABTS 测定法量化了化学计量级的自由基清除能力（n₁₀ 值）。在 HT29 结肠癌细胞中评估了细胞抗氧化活性。使用 MTT 测定法评估了癌细胞（HT29）和正常结肠上皮细胞（CCD841 CoN）的细胞毒性，同时使用彗星试验评估了遗传毒性和对氧化 DNA 损伤的保护作用。据我们所知，这是首次在单一结构-活性框架内整合这些羟基苯甲酸的电化学性质、抗氧化潜力、细胞抗氧化活性、细胞毒性和遗传毒性的研究。

化学物质和试剂

本研究调查的羟基苯甲酸（HBAs）包括：Gentisic 酸（GE）、没食子酸（GA）、香草酸（VA）和原儿茶酸（PR），均购自 Sigma-Aldrich（美国）。使用的试剂包括：六氰合铁（III）钾、六水合三氯化铁、五水合硫代硫酸钠、1-二苯基-2-吡啶基肼（DPPH）、2,2′-偶氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、己烷、磷酸盐缓冲盐水（PBS）和 Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）。

所研究羟基苯甲酸的电化学性质

为了评估所研究的羟基苯甲酸（HBAs）的氧化还原行为，采用了两种互补的电化学技术：电位滴定（PT）和差分脉冲伏安法（DPV）。PT 可以监测水溶液中的氧化过程，并提供标准还原电位（E₀）——这是一个反映化合物电子捐赠倾向的热力学参数。较低的 E₀ 值表示更强的抗氧化性能。

讨论

本研究系统地比较了四种常见的羟基苯甲酸（GA、GE、PR 和 VA）的氧化还原和生物性质，表明它们的抗氧化行为在化学和生物学条件下主要由化学结构决定，特别是羟基和甲氧基取代基的数量和相对位置。

结论

本研究使用电化学、光谱学和基于细胞的方法，系统地比较了四种结构相关的羟基苯甲酸（GA、GE、PR 和 VA）。虽然羟基密度在化学和电化学系统中显著决定了抗氧化潜力，但这些性质转化为细胞反应的过程是非线性的且依赖于具体情境。没食子酸和 Gentisic 酸表现出最强的抗氧化活性。

CRediT 作者贡献声明

Izabela Koss-Miko?ajczyk：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、可视化、验证、软件使用、方法学、实验设计、数据分析、概念化。 Monika Kuczyńska：方法学、实验设计、概念化。 Klaudia Suliborska：方法学、实验设计。 Klaudia Tiszbein：可视化、实验设计。 Zuzanna Koziara：实验设计。 Jacek Namie?nik：监督、资源管理、项目协调、资金获取。 Wojciech Chrzanowski：

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究由 波兰国家科学中心 通过 MAESTRO 6 计划（申请编号 2014/14/A/ST4/00640）资助。