《Innovative Food Science & Emerging Technologies》：Improving functional and interfacial performance of whey protein by pH shift combined with enzymatic glycosylation modification and its effect on high internal phase emulsions
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乳清蛋白浓缩物（WPC）经pH12预处理结合酶促共价修饰制备高内相乳液（HIPEs），系统研究修饰对蛋白结构、功能特性及HIPEs稳定性的影响。最佳条件为30min pH12预处理，WPC-AX共轭体乳化活性最优，且与CMCS共价结合后HIPEs微观结构更均一，冻融稳定性达三次循环无分层。
作者：徐路迪 | 刘培珠 | 李彦军 | 埃伊图约·杜杜 | 罗一平 | 程金菊 | 江玉军
教育部乳品科学重点实验室（KLDS），东北农业大学，哈尔滨，黑龙江 150030，中国
摘要
由蛋白质-多糖复合物系统制备的高内相乳液（HIPEs）因其在食品、制药和化妆品领域的潜在应用而受到关注。在本研究中，使用乳清蛋白浓缩物（WPC）作为原料，并通过pH 12处理（0、30、60和90分钟）对其结构和功能进行了改性，这导致蛋白质部分 unfolding并暴露出活性基团。随后，采用辣根过氧化物酶（HRP）催化的阿拉伯木聚糖（AX）接枝和转谷氨酰胺酶（TGase）介导的羧甲基壳聚糖（CMCS）共价偶联对预处理的WPC进行了双重改性。系统地研究了改性WPC的结构和功能特性，包括与多糖的相互作用程度、傅里叶变换红外光谱、荧光光谱、溶解度、乳化性能和界面吸附行为，以及这些特性对HIPEs的影响。最佳酶促糖基化改性条件确定为pH 12处理30分钟，在此条件下WPC与AX和CMCS的接枝程度最高，WPC-AX conjugates在所有样品中（包括WPC和WPC/AX混合物）表现出最佳的乳化活性和溶解度，验证了pH变化和酶促糖基化的协同效应。光学形态和CLSM图像的微观结构分析显示，糖基化的WPC稳定的HIPEs具有更小的液滴和更均匀的液滴分布，优于仅由WPC或WPC/AX(CMCS)混合物稳定的HIPEs。30-WPC-AX乳液在三次冻融循环后表现出最佳的冻融稳定性，没有发生水油分离。30-WPC-CMCS乳液的G'和G"值以及表观粘度高于天然WPC和30-WPC-AX乳液。本研究对于制备食品级HIPEs具有重要意义，同时也为研究蛋白质-多糖 conjugates在油水界面的稳定性提供了信息。
引言
高内相乳液（HIPEs）是一种凝胶状的乳液，在食品产品中具有广泛的应用（Hu, Xiao等人，2023年）。在食品工业中，改性或天然食品材料是制备HIPEs的宝贵来源（Lu等人，2024a）。相比之下，只有少数研究使用单一蛋白质来制备HIPEs。为了获得适当的亲水性以稳定HIPEs，大多数蛋白质必须被改性或与其他生物聚合物（包括多糖）偶联（Pan等人，2025年）。
乳清蛋白是一种从乳清（奶酪生产过程中的液体副产品）中提取的球状蛋白质混合物，约占牛奶总蛋白的20%。牛奶乳清蛋白浓缩物（WPC）由于其高蛋白含量和功能性，在食品工业中是一种有价值的成分。它被用于各种产品中，包括饮料、膳食补充剂和烘焙食品（Ayyash等人，2025年）。乳清蛋白还具有自由氨基和羧基，可以通过多种方法（包括酶促交联和化学交联）进行共价交联。这些方法可以改进乳清蛋白的结构和功能特性，从而更有效地利用乳清蛋白。
pH变化处理是一种在极端酸性或碱性条件下诱导蛋白质变性一段时间，然后将其恢复到中性pH的方法。在极端pH条件下，蛋白质分子内部的侧链基团由于静电相互作用而增强分子间的排斥力，导致蛋白质 unfolding（Yang等人，2025年）。当蛋白质重新调整到中性时，分子间的排斥力减弱，蛋白质结构重新折叠。经过pH 12处理后，蛋白质变得更加柔韧，两亲性增强，但仍然相对紧凑，称为熔融球（MG）状态（Huang等人，2023年）。Shen等人（2022年）指出，碱性pH变化处理对增强豌豆蛋白分离物的乳化性能具有显著潜力。Yu等人（2021年）报告称，在pH 13的条件下，卵白质的乳化活性和乳液稳定性均得到提高。Gong等人（2025年）研究了通过超声处理结合pH变化处理对Hericium erinaceus蛋白的改性，与仅进行pH变化处理相比，其发泡性能和乳化活性显著提高。
涉及Melad过程的糖基化反应已被广泛用于食品中的蛋白质改性，而与改性蛋白质的酶促糖基化偶联相关的研究仅在近年来出现。根据多糖的结构和数量，酶促合成的蛋白多糖缀合物的性能通常优于未改性的蛋白质（Boeriu等人，2004年）。葡糖胺和壳聚糖是常用的蛋白质糖基化修饰剂。羧甲基壳聚糖（CMCS）具有良好的生物相容性、生物降解性和生物活性。此外，CMCS可以在转谷氨酰胺酶（TGase）的存在下与蛋白质发生共价反应，TGase是一种催化酰基转移反应和蛋白质分子内及分子间偶联的酶。TGase的作用机制如下：它催化蛋白质或肽中的γ-羟胺基团（酰基供体）与一级胺化合物（酰基受体）之间的反应（Shi等人，2020年）。阿拉伯木聚糖（AX）主要存在于谷物麸皮中，其中阿拉伯糖残基通过酯键与阿魏酸（FA）相连。阿魏酸化的阿拉伯木聚糖可以通过氧化酶与蛋白质发生氧化偶联反应（Liu等人，2023年）。辣根过氧化物酶（HRP）是一种含有血红素的酶，已研究了一个多世纪。先前的研究表明，在H2O2和HRP的催化下，AX可以接枝到BSA上，所得BSA-AX conjugate具有改善的乳化活性和稳定性（Lv等人，2022年）。Wang和Wang（2025年）指出，低温酶促糖基化可以提高明胶/壳聚糖缀合物的持水能力、自由基清除率和乳化活性。
简而言之，与蛋白质相比，蛋白质-多糖 conjugate可以同时具备蛋白质的优异乳化性能和多糖的流变特性。通过酶促糖基化引入的多糖链可以为乳液提供稳定的空间障碍和环境稳定性。尽管有许多关于蛋白质和多糖酶促偶联的报道，但乳清蛋白的紧凑结构影响了其在酶催化作用下的多糖结合程度。pH变化处理也是一种绿色加工方法，可以改变蛋白质的空间结构并提高酶的 accessibility。迄今为止，pH 12处理和酶促糖基化的组合尚未用于研究其对食品蛋白质功能的影响。因此，我们主要研究了pH 12处理（0、30、60和90分钟）对两种酶促糖基化WPC的糖基化程度、粒径、溶解度、乳化和发泡性能的影响。随后，使用筛选出的最佳处理条件改性的乳清蛋白浓缩物制备了HIPEs，以研究不同改性WPC对HIPEs的微观结构、流变性能和稳定性的影响，并深入探讨环境因素对乳液稳定性的影响规律，为其在食品行业的应用提供理论支持。
乳清蛋白浓缩物（WPC，纯度≥80%）、阿拉伯木聚糖（AX）、辣根过氧化物酶（HRP）、羧甲基壳聚糖（CMCS）和转谷氨酰胺酶（TGase）购自上海源叶生物科技有限公司（中国上海），初级大豆油购自哈尔滨的当地超市（中国）。所有其他化学品均为分析级。
将6克蛋白质溶解在190毫升去离子水中。溶解后，将溶液的pH调整至12并保持稳定
WPC中自由氨基含量的变化可以用来指示WPC与CMCS之间的相互作用程度（Sun, Zhao, Liu, Shi, Zhang, Xia, & Shen, 2024）。如图1A所示，WPC在pH变化处理30分钟后自由氨基含量显著下降，并随着处理时间的延长达到平台值。混合物和conjugates的值显著增加，然后在pH变化处理后趋于平稳
本研究通过pH变化处理结合酶促糖基化成功构建了乳清蛋白浓缩物（WPC）与阿拉伯木聚糖（AX）和羧甲基壳聚糖（CMCS）的conjugates。系统研究了它们对蛋白质结构、功能特性和高内相乳液（HIPEs）稳定性的影响。随着pH变化处理时间的增加，WPC的溶解度和乳化活性呈现负相关关系。
徐路迪：撰写——原始草稿、方法学、研究。
刘培珠：验证、研究、数据管理。
李彦军：验证、研究、数据管理。
埃伊图约·杜杜：正式分析。
罗一平：正式分析。
程金菊：撰写——审稿与编辑、方法学、资金获取。
江玉军：监督、概念化。
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作者声明没有利益冲突。
本工作得到了黑龙江省自然科学基金（序列号YQ2023C020）、中国博士后科学基金资助项目（序列号2023MD734140）、黑龙江省博士后科学基金（序列号LBH-Z23075）、“黑龙江省双一流学科协同创新成果项目（序列号LJGXCG 2023-060）以及乳品科学重点实验室开放研究基金（东北）的支持。
