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本研究创新性设计多功能CP/ZnO/AV水凝胶，通过ZnO调控M1巨噬细胞增强先天免疫，释放凋亡小体（AVs）调节成骨免疫微环境，促进骨髓间充质干细胞招募增殖及骨再生，小鼠模型验证其显著疗效。
刘嘉毅|张明进|李静|于毅|王奇瑞|丁晓阳|熊晨毅|蔡天宇|郝宝东|尹长|张婷|冯光耀|于婷婷|王星|刘大伟
北京大学口腔医学院及医院正畸科，北京，100081，中国
摘要
治疗大范围的感染性骨缺损仍然具有挑战性，主要原因是早期病原体清除不足以及持续的促炎性骨免疫微环境。目前的免疫调节策略主要集中在早期M2巨噬细胞的极化上，但忽视了M1巨噬细胞在病原体清除中的关键作用，导致感染控制不充分和骨再生受损。本文开发了一种多功能CP/ZnO/AV水凝胶，其中含有间充质干细胞衍生的凋亡小泡（AVs）和ZnO纳米颗粒，以调节感染性骨缺损的先天-骨免疫级联反应。该水凝胶通过咖啡酸修饰明胶与PEG-苯甲醛的交联快速形成，具有优异的机械性能、自愈能力和抗氧化特性。值得注意的是，该系统不仅通过短暂的M1激活来增强先天免疫，还通过控制AVs的释放来调节免疫反应。早期释放的ZnO使AVs的吸收增加了3.6-4.6倍，从而最大化了AVs的生物利用度，促进了骨髓间充质细胞（BMSCs）的招募、增殖和骨形成。在感染性下颌骨缺损的小鼠模型中，CP/ZnO/AV有效重塑了免疫微环境，增强了BMSCs的招募和增殖，并加速了骨再生。这项工作开创了一种序贯自增强递送系统，用于时空调节先天-骨免疫反应，为感染性骨缺损提供了一种有前景的治疗策略。
引言
由创伤、肿瘤、骨髓炎和根尖周牙周炎引起的大范围感染性骨缺损是一个主要的临床挑战[1]，[2]。目前常用的临床方法是结合骨移植和抗生素[3]，[4]，[5]。然而，清创手术往往无法完全清除病原体，传统的骨修复材料缺乏抗菌和免疫调节性能，导致慢性炎症、反复感染和骨再生不完全[6]，[7]。此外，当宿主免疫力受损时，过度依赖抗生素会破坏微生物生态系统并抑制移植物的骨诱导活性，导致抗菌效果和骨修复的“双重损失”。鉴于这些挑战，迫切需要增强身体的自我免疫调节能力，并开发新的骨组织工程策略，以有效平衡抗菌和骨诱导性能[8]，[9]。
骨免疫学在骨愈合过程中起着关键作用[10]，[11]，[12]。当感染性骨组织遇到病原体时，细菌中的病原体相关分子模式（PAMPs）会被识别。巨噬细胞是第一响应者，它们会趋化性地迁移到感染部位并极化为M1表型。它们产生大量的促炎介质，如肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-1和一氧化氮（NO），以消除入侵的微生物并激活适应性免疫，帮助宿主抵抗病原体[13]。然而，如果感染巨噬细胞中的活性氧（ROS）水平不足，病原体可能在细胞内存活，导致巨噬细胞转变为抗炎性M2表型[14]。因此，感染巨噬细胞需要适当的引导来重新调节其M1亚群，以支持先天抗菌免疫。目前的骨组织工程策略主要集中在加速M2型转化，以重塑再生性骨免疫微环境。然而，忽视M1巨噬细胞的作用可能导致感染早期的病原体清除不足，从而引发持续的慢性炎症反应和骨再生受损[15]。因此，在初始感染阶段及时增强先天免疫并建立抗炎和骨修复微环境至关重要，这对骨再生生物材料的免疫调节功能提出了更高的要求。
氧化锌（ZnO）以其优异的生物相容性、稳定性和广谱抗菌性能而闻名。其纳米颗粒可以被细胞内化[16]，[17]，其效果强烈依赖于局部浓度。在高浓度下，ZnO可诱导M1巨噬细胞的极化并刺激细胞的吞噬活性[18]。然而，巨噬细胞的重新编程是一个极其复杂的过程，受多种因素的影响，如Zn2+的释放速率、局部浓度和感染发展阶段。一些研究还表明，在低浓度下，ZnO可促进M2巨噬细胞的极化并支持骨形成[19]，[20]。之前的骨组织工程策略主要关注ZnO的抗菌性能，忽视了其在感染情况下对巨噬细胞极化的影响及其对细胞吞噬的作用。本研究旨在利用ZnO赋予M1巨噬细胞抗菌能力，并利用其吞噬刺激效应来递送免疫调节生物活性物质。凋亡小泡（AVs）是在细胞凋亡后产生的，其内容物包括脂质、蛋白质、核碎片和细胞器。与外泌体相比，AVs产量更高、成本更低，并具有强大的内在免疫调节和骨形成功能，生产过程更可控且一致[21]。我们之前的研究表明，全身注射AVs在骨质疏松小鼠中具有骨修复效果，强调了它们在维持骨稳态中的基本作用[22]。尽管AVs表面的“寻找我，吃我”信号能有效引导细胞到达目标，但AVs的内化效率仍然较低[23]，限制了其作为当前载体递送时的生物利用度。因此，开发能够响应感染微环境、按需释放生物活性因子并提供适当机械性能和生物相容性的骨再生支架至关重要，以改善AVs的递送和治疗效果。
在这项工作中，通过咖啡酸修饰明胶（CaG）、PEG-苯甲醛（PEG-Bz）、ZnO和BMSCs衍生的AVs（通过Schiff碱反应和Zn2+-儿茶酚螯合作用）的混合，设计了一种多功能水凝胶系统（CP/ZnO/AV），以增强先天免疫并修复感染性下颌骨缺损（图1）。这种多交联水凝胶表现出一系列优异的性能，包括可注射性、可靠的粘附性、自愈性、pH响应性、广谱抗菌性、抗炎性和抗氧化性。咖啡酸中的酚羟基部分能够与ZnO纳米颗粒结合[24]，从而稳定Zn2+-儿茶酚螯合，增强机械强度并控制Zn2+的持续释放。这种多功能平台整合了三个关键组成部分：首先，ZnO纳米颗粒的微环境响应性释放可通过触发代谢重编程来诱导M1巨噬细胞的极化，从而增强ZnO的抗菌效果；其次，为了防止过度M1激活引起的长期促炎反应，AVs会从CP/ZnO/AV水凝胶中及时释放，通过miR1324/SNX14/SMAD1/5信号轴调节骨代谢；第三，早期释放ZnO通过激活吞噬细胞和干细胞的吞噬功能提高了AVs的递送效率，吞噬相关基因（如MFGE8和Gas6）的表达水平增加了1.4至3.7倍，这也使AVs的递送效率提高了3.6至4.6倍，增强了其免疫调节和骨形成功能。体外评估显示了显著的抗菌活性、巨噬细胞极化的序贯诱导以及BMSCs的水平迁移、增殖和骨形成分化的改善。值得注意的是，CP/ZnO/AV适应了缺损腔体，使BMSCs能够迁移并创建一个有利的骨形成微环境。该多功能水凝胶系统通过响应感染微环境，激活了身体的先天骨免疫过程，重建了大范围的骨缺损，显示出显著的转化潜力。
CP/ZnO/AV水凝胶的设计与表征
为了封装和控制生物活性因子的释放，设计了一种双交联网络，模仿细胞外基质（ECM），采用金属-儿茶酚和动态Schiff碱相互作用的双交联策略。CaG和PEG-Bz被用作水凝胶的主链段。通过碳二亚胺化学将咖啡酸接枝到明胶的氨基上，生成CaG（图1A）[26]。混合CaG和PEG-Bz后（交联的水凝胶网络结构为
结论
总之，开发了一种多功能CP/ZnO/AV水凝胶支架，具有易于注射、自愈、可靠粘附、生物安全性以及广谱抗菌和抗氧化性能。多交联策略，包括动态共价键、金属-儿茶酚螯合和氢键网络，协同增强了其机械和生物活性。更重要的是，该水凝胶系统不仅能够促进细胞的增殖、迁移和骨形成
材料与动物
四聚PEG-苯甲醛（Tetra-PEG-Bz，Mw = 10 kDa）购自SINOPEG（厦门，中国）。明胶（Mw ≈ 60 kDa）购自Sigma–Aldrich。1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDCI）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）等试剂购自Energy Chemical。咖啡酸（Mw ≈ 180.16 Da）、二甲基亚砜（DMSO）和乙二胺购自ENERGY CHEMICAL。氧化锌购自安徽Senrise科技有限公司。纤维蛋白胶
作者贡献声明
刘嘉毅：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，可视化，项目管理，数据管理。张明进：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目管理，数据管理，概念构思。李静：监督，软件，方法学，形式分析，数据管理。于毅：软件，方法学，形式分析，数据管理。王奇瑞：项目管理，方法学，数据管理，概念构思。丁晓阳：方法学
利益冲突声明
作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（82571132、82271009、52373123、52573186、52373162）、北京市自然科学基金（F252067、L222116、L244037）、国家重点研发计划（2022YFA1206100）、国家多学科重大疾病合作治疗计划（PKUSSNMP202020）、中国口腔健康基金会（A202105）和北京市医师科学家培训项目（BJPSTP-2025-01）的支持。
