一种协同递送的纳米平台，可实现STING信号的协同激活以及PI3K和COX-2的双重阻断，从而增强癌症免疫疗法的效果

协同激活cGAS-STING通路并抑制PI3K/COX-2信号的多功能纳米系统显著重塑肿瘤免疫微环境，诱导免疫原性细胞死亡，促进树突状细胞成熟和M1型巨噬细胞极化，在B16黑素瘤小鼠模型中实现近完全肿瘤抑制。

　　

张哲|常瑞白|范金殿|梁炳静|郑龙|范瑞|黄欣|王一通|吕静怡|杨晓婷|贝拉尔·阿卜杜拉|哈立德·A.M. 阿布齐德|王新通|杜波|钟玉旭|孔德鑫

天津医科大学药学院临床治疗与诊断技术发展关键实验室，教育部国际眼科疾病联合实验室，免疫微环境与疾病关键实验室（教育部），中国天津300070

摘要

肿瘤微环境（TME）的免疫抑制特性一直是有效癌症免疫治疗的主要障碍。为克服这一难题，我们开发了一种多功能共递送纳米系统，旨在同时激活先天免疫系统的cGAS-STING通路并破坏关键的免疫抑制机制。该系统通过联合使用基于锰/PI3K抑制剂的纳米颗粒（MT@KM NPs）和包裹COX-2抑制剂的脂质体（CXB@Lip）来实现这一目标。这种联合疗法通过多种机制表现出强大的抗肿瘤效果。具体而言，该疗法诱导了强烈的免疫原性细胞死亡（ICD），促进了树突状细胞的成熟，并显著地将肿瘤相关巨噬细胞重新编程为抗肿瘤的M1表型。在B16黑色素瘤小鼠模型中，该疗法彻底重塑了TME，表现为树突状细胞的浸润增加、M1巨噬细胞的极化增强以及细胞毒性CD8⁺ T细胞的显著浸润，从而几乎完全抑制了肿瘤生长，同时具有出色的安全性。转录组分析进一步证实了TME向免疫激活状态的转变，其特征是抗原处理和呈递相关通路、趋化因子信号通路以及强烈的干扰素α/γ反应显著上调。这项工作验证了一种将免疫“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤的强大纳米医学策略，为先进癌症免疫治疗提供了有希望的平台。

引言

免疫疗法从根本上改变了癌症的治疗方式，与传统方法相比，它具有更高的特异性、更低的不良反应和更持久的疗效。[1]、[2]、[3]然而，其疗效常常受到高度免疫抑制的肿瘤微环境（TME）的限制，表现为“冷”肿瘤中T细胞浸润不足、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）主要呈M2表型以及调节性T细胞（Tregs）的存在[4]、[5]、[6]。克服这些不足的一个核心策略是利用先天免疫系统，从而促进强大的适应性免疫反应。最近的突破表明，诱导强烈的免疫原性细胞死亡可以激活免疫系统，克服TME的阻碍。特别是，专门设计的促进树突状细胞成熟的纳米平台已被证明能够激活全身性的抗肿瘤反应[7]、[8]、[9]。这些生物学结果证实了TME的重编程对于有效的免疫治疗至关重要。

在这种背景下，环状GMP-AMP合成酶（cGAS）-干扰素基因刺激因子（STING）通路已成为一个关键的先天免疫级联反应，其激活可诱导I型干扰素（IFNs）[10]、[11]、[12]。STING的激活还能促进TAMs向促炎性的M1表型极化，并促进树突状细胞（DC）的成熟和T细胞的浸润，有效将“冷”肿瘤转化为免疫原性环境[13]、[14]、[15]。锰离子（Mn²⁺被认为是有前景的cGAS-STING激活剂，因为它们能够直接增强cGAS的酶活性并提高其对DNA的敏感性，从而促进STING通路的强烈激活。此外，Mn²⁺可以通过将过氧化氢转化为细胞毒性羟基自由基来增强免疫原性细胞死亡（ICD）[16]、[17]。

尽管STING激活具有巨大潜力，但其治疗效果常常受到TME内强大反馈机制的抑制。其中一个主要障碍是过度激活的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）信号通路，该通路与肿瘤进展和免疫抑制密切相关[18]、[19]。使用特异性抑制剂靶向这一通路可以通过逆转免疫抑制状态来增强抗肿瘤免疫[20]、[21]。我们的研究小组此前开发了KTC1101，这是一种新型的广谱PI3K抑制剂，对PI3Kα和PI3Kδ都具有强效抑制作用，能够破坏肿瘤的代谢和生长，同时增强T细胞的激活和增殖，恢复抗肿瘤免疫[22]。因此，将PI3K抑制剂与STING激动剂结合使用是一种合理的策略，可以重新编程TME，因为PI3K抑制可以抑制Tregs和M2样TAMs等免疫抑制细胞，从而最大化STING通路的免疫刺激效果[23]、[24]、[25]。

除了PI3K介导的耐药性这一障碍外，STING激活还可能触发一个有害的反馈循环，削弱其自身的治疗效果。STING激动剂可能会无意中在肿瘤组织中上调环氧化酶-2（COX-2）的表达[20]、[26]。这会导致前列腺素E2（PGE2）的产生增加，从而促使巨噬细胞向免疫抑制的M2样状态转变，同时促进促肿瘤形成的髓系细胞（如MDSCs和Tregs）的招募和维持，从而阻碍有效的抗肿瘤免疫[27]、[28]。这种补偿性的免疫抑制限制了STING激活的效果，导致药物耐药性和免疫逃逸[29]。因此，抑制COX-2对于中和这一负面反馈循环至关重要，因为它可以通过将TAMs重新编程为免疫刺激性的M1表型，减少MDSCs和Tregs的数量，同时增加CD4⁺和CD8⁺ T细胞的浸润来缓解免疫抑制的TME[30]、[31]、[32]、[33]。

这些相互关联的挑战表明，最佳的治疗策略应同时激活STING通路并破坏由PI3K和COX-2驱动的免疫抑制机制。然而，由于各组分的物理化学性质不同，实现这种治疗协同作用十分复杂。亲水性的Mn²⁺离子和疏水性小分子抑制剂在药代动力学、生物利用度和系统性毒性方面存在不匹配，这阻碍了它们在肿瘤部位的有效共递送和协同作用。这些问题需要一种复杂的纳米载体来提高生物利用度、稳定性和在肿瘤部位的靶向定位。

为了解决这些挑战，新兴的金属免疫疗法领域利用基于金属的纳米激活剂来激活免疫“冷”肿瘤。特别是，锰已被证实是一种有效的激动剂，能够显著降低cGAS-STING通路的激活阈值，提供启动强大抗肿瘤免疫级联反应所需的先天刺激[34]。通过将这些金属离子整合到多功能纳米平台中，可以实现协调的免疫反应，从而结合先天免疫和适应性免疫。基于这一理念，我们设计并构建了一种组合共递送纳米系统（方案1）。首先通过金属配位反应将KTC1101和Mn²⁺结合形成KM纳米颗粒（NPs），然后通过用额外的Mn²⁺和单宁酸（TA）修饰表面来形成稳定的金属-酚类网络，最终制备出MT@KM NPs。同时，将COX-2抑制剂塞来昔布封装在脂质体中，制备出CXB@Lip。通过结合STING激活和PI3K及COX-2的抑制，我们旨在重塑免疫微环境，增强抗肿瘤效果，为黑色素瘤的治疗提供一种新策略。

材料

KTC1101是在我们实验室按照先前描述的方法制备的。塞来昔布购自北京Solarbio科技有限公司。单宁酸（TA）购自大连美伦生物技术有限公司。四水合氯化锰（MnCl?·4H?O）、无水乙醇和氯仿购自天津凯米欧化学试剂有限公司。高纯度胆固醇（CHO-HP）、大豆卵磷脂和DSPE-PEG2000购自AVT（上海）医药技术有限公司。

MT@KM NPs的制备与表征

无载体纳米药物在癌症治疗中具有巨大潜力，因为它们具有高药物装载效率、避免载体相关毒性以及合成简便等优点[35]。我们之前的研究表明，PI3K抑制剂可以用于轻松制备无载体纳米颗粒[36]、[37]。利用金属免疫疗法的原理，Mn²⁺不仅通过促进STING通路来增强免疫反应，还

结论

在这项研究中，我们设计了一种共递送纳米系统，通过同时激活cGAS-STING通路并抑制PI3K和COX-2信号通路来克服肿瘤微环境的免疫抑制。我们的联合疗法MT@KM NPs和CXB@Lip表现出强大的抗肿瘤效果。从机制上看，该疗法诱导了直接的细胞毒性，引发了强烈的免疫原性细胞死亡，并通过促进DC成熟、M1巨噬细胞极化和细胞毒性

CRediT作者贡献声明

张哲：资源提供、概念构思。常瑞白：项目管理、实验研究、数据分析、数据整理。范金殿：写作 - 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法验证。梁炳静：数据分析、数据整理。郑龙：软件开发、方法设计、实验研究。范瑞：数据分析。黄欣：方法设计。王一通：数据分析。吕静怡：数据可视化、结果验证。杨晓婷：数据可视化

贡献

本手稿的撰写得到了所有作者的共同努力。所有作者均已批准最终版本的手稿。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

张哲、常瑞白和范金殿对这项工作做出了同等贡献。本研究得到了国家自然科学基金 [82204461、82061148017]、天津市自然科学基金 [24JCZDJC00120、24PTLYHZ00280、24JCYBJC00490、25JCLMJC00870]、NMPA碳水化合物类药物质量研究与评价重点实验室 [2023QRECM05]以及国家药物研究重点实验室 [SKLDR-2024-KF-04]的资助。我们感谢天津医科大学的何明珠女士和曾伟女士的支持。