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本研究设计了一种单原子铁纳米酶FTF，通过表面修饰实现肿瘤靶向递送，在酸性环境中释放胆固醇合成抑制剂TASIN-30，阻断7-DHC生成以削弱肿瘤的“胆固醇屏障”，同时铁纳米酶的过氧化氢酶样活性催化产生活性氧并耗竭谷胱甘肽，协同诱导铁凋亡和凋亡，实现82.5%的肿瘤抑制率，且最大耐受剂量达7.5 mg/kg。
朱俊|陈静静|王聪聪|于德宏|赵明浩|闫汉荣|黄茹琪|王振新|潘斌|高凤蕾
徐州医科大学附属医院骨科，中国徐州 221002
摘要
肿瘤中活性氧（ROS）生成不足以及高度活跃的胆固醇代谢是限制传统铁死亡（ferroptosis）为基础的癌症疗法疗效的两个主要障碍。在这里，我们设计了一种单原子铁纳米酶（Fe-NC@TASIN-30@FA，简称FTF），通过同时输送一种远端胆固醇合成抑制剂并催化增强ROS的产生，来克服肿瘤对铁死亡的抵抗并使其对凋亡耦合的催化疗法敏感。FTF是通过将选择性7-脱氢胆固醇（7-DHC）合成抑制剂TASIN-30装载到单原子铁纳米酶上，并进一步用叶酸修饰的聚乙二醇（SH-PEG-FA）进行功能化来构建的，从而赋予其肿瘤靶向能力。值得注意的是，TASIN-30的装载率为22.5%，在不会影响纳米酶活性的情况下实现了有效的载荷传递。FTF中的铁活性中心表现出双重酶模拟活性：一种是类似过氧化物酶的活性，可将H?O?分解为羟基自由基；另一种是类似谷胱甘肽过氧化物酶的活性，可催化还原型谷胱甘肽氧化为氧化型谷胱甘肽，从而增加细胞内ROS水平并消耗抗氧化剂，实现协同的铁死亡效应。此外，通过抑制7-DHC和胆固醇的生物合成，FTF加速了肿瘤细胞内多余胆固醇的消耗，破坏了脂质筏的完整性，进而抑制了肿瘤细胞的增殖。在携带143B肿瘤的裸鼠实验中，FTF的体内肿瘤抑制率约为82.5%，其最大耐受剂量为7.5 mg/kg。总体而言，本研究提出了一种新的治疗策略，将胆固醇代谢干扰与催化纳米酶疗法相结合，为对传统治疗耐药的肿瘤提供了一种有效的铁死亡-凋亡协同机制。
引言
肿瘤治疗中的一个持续挑战是恶性细胞通过上调抗凋亡信号以及肿瘤的表型异质性，能够逃避传统化疗药物诱导的凋亡[1]、[2]、[3]、[4]。虽然凋亡诱导仍是大多数细胞毒性疗法的基石，但其疗效越来越受到肿瘤内适应性抵抗机制的制约，例如BCL-2家族蛋白的表达增强和代谢重编程[5]、[6]、[7]。这些抵抗机制阻碍了肿瘤的彻底清除，导致复发和耐药性的产生。因此，癌症治疗领域正在逐步探索替代形式的调控性细胞死亡，以绕过传统的抵抗机制。特别是，针对耐药肿瘤细胞的代谢脆弱性并诱导替代形式的细胞死亡，为克服对传统化疗的抵抗提供了强有力的补充策略。
铁死亡是一种依赖铁的调控性细胞死亡形式，其特征是细胞膜上脂质过氧化物的灾难性积累，在机制和形态上与凋亡不同[8]、[9]、[10]。在同一肿瘤细胞中同时诱导凋亡和铁死亡可以激活两条平行的致命途径，从而克服对单一细胞死亡机制的抵抗，实现更彻底的肿瘤清除[11]。然而，肿瘤细胞常常进化出代谢上的适应性改变，减弱了铁死亡的效果。其中，侵袭性肿瘤中胆固醇生物合成途径的上调已被证实会抑制铁死亡[12]、[13]、[14]、[15]。胆固醇代谢为肿瘤提供了结构、能量和抗氧化能力的“三重支持”。具体来说，胆固醇不仅是细胞膜的基本结构成分，还参与脂质筏的形成和多种促增殖信号通路的组装[16]、[17]、[18]。通过增强从头合成胆固醇和胆固醇的摄取，肿瘤细胞可以稳定其质膜，使膜脂质更不易被过氧化，并维持相对较高的细胞内抗氧化状态[19]、[20]。结果，铁死亡所依赖的脂质过氧化（LPO）链反应被减弱。值得注意的是，7-脱氢胆固醇（7-DHC）作为胆固醇生物合成途径中的关键中间体，已被发现是一种内源性铁死亡抑制剂[21]。从机制上看，7-DHC具有 conjugated diene 结构，可以清除活性自由基，从而保护细胞膜免受过氧化损伤。多项研究表明，肿瘤细胞内7-DHC水平越高，其对铁死亡的敏感性越低，有效地形成了对抗铁催化LPO的“固醇屏障”。重要的是，抑制7-DHC的合成可以消除这一保护屏障，使细胞重新对铁死亡敏感。因此，针对胆固醇代谢的远端步骤——特别是抑制7-DHC的生成——是一种非常有前景的方法，可以增强基于铁死亡的抗癌疗法。
已经投入了大量努力来开发针对胆固醇生物合成途径远端的小分子抑制剂。其中，TASIN-30是一种明确且有效的药理学抑制剂，它靶向胆固醇合成所必需的甾醇异构酶EBP[22]。抑制EBP可以有效阻断7-DHC的生成，从而削弱肿瘤细胞的固有铁死亡防御能力。然而，这些小分子单独用于治疗仍面临几个实际挑战。首先，它们本身在水中的溶解度较差，体内生物利用度有限，难以达到体外观察到的有效浓度[23]、[24]。其次，小分子抑制剂通常缺乏内在的肿瘤选择性，因此分布不均匀，导致脱靶效应[25]、[26]。第三，独特的肿瘤微环境（特征为间质液压力升高、细胞外基质密集和缺氧）为自由药物的有效肿瘤内积累带来了额外障碍[27]、[28]。更重要的是，抑制胆固醇代谢主要起到“解除制动”的作用，使肿瘤细胞更容易受到铁死亡的影响；然而，在缺乏足够强的铁死亡触发因素的情况下，这种敏感性可能仍不足以诱导强烈的肿瘤细胞死亡。
为了克服小分子EBP抑制剂在实际应用中的固有局限性，并更有效地增强铁死亡的诱导效果，具有高度多孔结构的金属纳米酶平台受到了越来越多的关注[29]、[30]、[31]、[32]、[33]。在各种纳米酶系统中，原子分散的金属催化剂表现出出色的催化性能，因为它们充分利用了金属原子，并具有明确的配位环境[34]、[35]、[36]、[37]、[38]。特别是，金属-N?配位结构形成了稳定的催化位点，优化了金属中心的电子环境，从而促进了自由基的生成和谷胱甘肽（GSH）的氧化，这有助于弥补传统小分子药物在诱导铁死亡方面的不足[39]、[40]、[41]。金属-N?基元在复杂的肿瘤微环境中也表现出高催化效率和稳定性[42]、[43]。当这些单原子位点嵌入具有高比表面积和多孔结构的氮掺杂碳基质中时，它们能够促进反应物种的有效扩散，并为装载TASIN-30提供充足的空间，有助于克服肿瘤组织中的渗透和扩散障碍[44]、[45]、[46]。总体而言，基于氮掺杂碳基质的多孔金属单原子纳米酶为EBP抑制剂的协同递送和铁死亡的选择性激活提供了一个多功能平台，显示出在肿瘤治疗中的巨大潜力。
基于此，我们设计了一种铁单原子纳米酶FTF，它将TASIN-30的靶向递送与Fe-N?介导的级联催化相结合，通过胆固醇代谢调节实现铁死亡-凋亡协同的肿瘤治疗（图1）。具体来说，我们首先通过将原子分散的铁原子锚定在氮掺杂的碳骨架上，制备了一种Fe-N?单原子纳米酶（Fe-NC），使其既作为高载荷载体，又作为催化平台。随后，我们用硫醇封端的叶酸修饰聚乙二醇（SH-PEG-FA）对其表面进行功能化，以提高水溶性、生物相容性和叶酸受体介导的肿瘤靶向性[47]、[48]。所得到的FTF通过增强的渗透性和保留效应优先在肿瘤组织中积累，并被过度表达叶酸受体的肿瘤细胞有效内化，同时在酸性肿瘤微环境中表现出TASIN-30的pH响应性释放[49]、[50]。因此，TASIN-30在肿瘤部位选择性释放，阻断7-DHC的生成并破坏胆固醇代谢建立的铁死亡保护屏障。同时，Fe-N?位点表现出类似过氧化物酶（POD样）的活性，在肿瘤细胞中催化ROS的生成；而其类似谷胱甘肽过氧化物酶（GPx样）的活性导致细胞内GSH的广泛耗竭，GPX4轴的失活以及LPO驱动的铁死亡损伤的放大。随后的ROS爆发引发了线粒体功能障碍和caspase依赖的凋亡，这与铁死亡损伤共同作用，在同一纳米酶内产生了强大的协同细胞死亡效应[51]、[52]。总体而言，本研究建立的FTF铁单原子纳米酶系统将胆固醇代谢干扰与纳米催化放大相结合，有助于克服肿瘤对铁死亡的固有耐受性。
材料与试剂
所有化学试剂和材料均按原样使用。六水合硝酸锌（Zn(NO?)?·6H?O）、乙酰丙酮铁、2-甲基咪唑、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、乙二醇和甲醇均从Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.（中国）购买，用于纳米酶前体的合成。TASIN-30（一种选择性的EBP抑制剂）从MedChemExpress（美国）获得。SH-PEG????-FA从Yusi Pharmaceutical Technology Co., Ltd.（中国）购买。细胞培养...
FTF纳米催化剂的表征
通过全面的物理化学表征，确认了FTF纳米酶的成功构建。最初，通过热解沸石咪唑酸盐骨架-8（ZIF-8）模板制备了Fe-NC单原子纳米酶，然后加载TASIN-30并用SH-PEG-FA进行表面功能化，得到了最终的FTF纳米催化剂。扫描电子显微镜（SEM）图像显示Fe-NC具有大致的菱形十二面体形态和多孔表面（图1a）。
结论
总之，我们设计了一种新型单原子纳米酶（FTF），它将胆固醇代谢调节与催化疗法相结合，通过诱导铁死亡和凋亡来增强肿瘤的清除效果。FTF独特地结合了能够生成ROS和消耗GSH的铁基纳米酶与小分子抑制剂TASIN-30，后者阻断了7-脱氢胆固醇的生物合成。这一双功能平台针对富含胆固醇的肿瘤...
CRediT作者贡献声明
朱俊：数据整理、概念构思。陈静静：正式分析、方法学。王聪聪：正式分析、方法学。于德宏：正式分析、数据整理、概念构思。赵明浩：正式分析、数据整理。闫汉荣：正式分析、数据整理、概念构思。黄茹琪：正式分析、数据整理、概念构思。王振新：正式分析、数据整理。潘斌：正式分析、数据整理。高凤蕾：可视化、验证、监督。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所述的工作。
致谢
作者感谢国家重点研发计划（2024YFF1206803）和国家自然科学基金（22174123）的财政支持。本文所述的研究是在徐州医科大学公共实验研究中心进行的。
