《ACS Food Science & Technology》：Enhanced Extraction of Bioactive Compounds from Brazilian Brown Propolis: Employing Pressurized Liquid Extraction in a Semicontinuous Flow-Through System
1. 引言
蜂胶是蜜蜂从植物分泌物中采集的树脂状物质，与唾液分泌物和蜂蜡混合而成。它在保护蜂巢方面起着至关重要的作用，既是天然的抗菌剂，也是抵御捕食者和病原体的物理屏障。除了其生物学功能，蜂胶因其复杂的化学成分（包括具有生物活性的黄酮类、酚类化合物、萜类化合物和其他生物分子）而成为广泛研究的焦点。这些特性使蜂胶在制药、化妆品和食品工业等各种应用中具有重要价值。
在世界各地发现的不同类型蜂胶中，巴西棕蜂胶因其丰富的化学成分和广泛的可用性而脱颖而出。最近的研究强调了该品种复杂的植物化学特征，其含有高浓度的抗氧化、抗菌和抗炎化合物。这些生物活性成分的存在赋予了棕蜂胶有前景的治疗特性，证明了对其科学和工业探索日益增长的兴趣是合理的。然而，要有效利用这些化合物，必须开发能够保留其特性并优化其使用的高效提取方法。
从蜂胶中提取生物活性化合物涉及多种技术，每种技术都有其特定特点。传统的提取方法，如浸渍、渗滤和基于溶剂的提取，由于其简单性和较低的运营成本，仍被广泛用于蜂胶加工。然而，这些方法通常存在重要限制，包括提取时间长、溶剂消耗高、选择性有限以及生物活性化合物可能发生热降解。这些缺点推动了替代提取策略的发展，以提高效率并减少环境影响。
在此背景下，加压液体提取（Pressurized Liquid Extraction， PLE）等先进提取技术已成为有前景的替代方案。PLE在受控的高压和高温条件下使用溶剂，促进生物活性化合物的选择性提取，同时减少对大量有机溶剂的需求。与传统方法相比，该方法具有若干优势，包括更高的产率、更短的处理时间以及目标化合物的降解减少。应用PLE从植物基质中获得次生代谢物已被广泛研究，证明其在提取黄酮类和酚类化合物方面相对于传统方法具有更高的效率。
除了PLE，另一项重要的技术创新是在提取过程中使用半连续流通系统。与溶剂与固体基质接触固定时间的静态方法不同，半连续系统能够实现溶剂的连续循环，促进更有效和均匀的提取。这种方法能够精确控制工艺变量，如温度、压力和流速，从而可能获得更高的选择性和改进的目标化合物回收率。此外，半连续流通系统增强了工业可扩展性，使过程在经济上更可行且在环境上更可持续。
对天然和功能性产品日益增长的需求强调了改进提取技术的必要性，特别是对于具有治疗潜力的生物活性化合物。例如，黄酮类化合物因其抗氧化特性而被广泛认可，这有助于中和自由基并保护人体细胞免受氧化损伤。同样，酚类化合物表现出显著的抗菌活性，并用于食品保藏和药物制剂。这些化合物从棕蜂胶中提取的效率直接影响其在最终产品中的适用性，凸显了创新方法对于确保其稳定性和生物利用度的重要性。
从棕蜂胶中提取生物活性化合物的另一个关键方面是过程的可持续性。传统提取方法通常产生大量的化学废物，并需要大量的能源和溶剂消耗。采用更可持续的方法，例如结合半连续流通系统的PLE，在这方面代表了重大进步。这些技术减少了有机溶剂的消耗并优化了提取产率，从而最大限度地减少了植物提取物生产的环境影响。此外，更高效的工艺可以降低生产成本，使蜂胶衍生产品在市场上更具可及性和竞争力。
在此背景下，本研究旨在研究使用半连续流通系统中的PLE对棕蜂胶生物活性化合物进行优化提取。选择此方法是为了提高工艺效率并获得高产的生物活性化合物而不损害其化学完整性。此外，本研究旨在通过探索适用于工业规模且符合可持续性原则的策略，为次生代谢物提取的技术创新做出贡献。
2. 材料与方法
2.1. 原材料
原始巴西棕蜂胶购自巴西巴拉那州北部地区的生产商。样品在强制通风烘箱中于35°C干燥24小时。此后，样品储存在黑暗干燥的环境中直至使用。
2.2. 半连续PLE
提取过程采用半连续PLE（图1）。提取反应器容量为110 mL，配备高效液相色谱泵。最初，水在预热器中加热，然后经过热交换器，再进入反应器。在提取过程中，使用测量范围为0至7500 psi、精度为0.1%的压力表以及K型热电偶监测压力和温度。
PLE过程在200 bar压力和5 mL min-1流速下进行30分钟，期间每5分钟收集一次等分试样。溶剂与进料（S/F）比为每克蜂胶60克水。选择200 bar压力足以在研究的温度范围内保持溶剂处于加压液体状态，同时确保工艺稳定性和安全操作。类似的压力条件已成功应用于使用流通式提取系统的相关生物质增值研究。
蜂胶提取过程采用两水平、三因素的中心复合设计进行设计。研究的变量为乙醇浓度（0–80%）、温度（60–120 °C）和pH（2–12）。表1展示了执行的16个实验处理。
2.3. 提取物的表征
2.3.1. 颜色参数
通过340至830 nm范围内的透射值获得CIELab系统的比色参数（L（亮度）、a（红/绿）和b*（蓝/黄）），读数在紫外-可见分光光度计上每5 nm进行一次。参数H°（色调角）使用公式1计算。
2.3.2. 总酚化合物（Total Phenolic Compounds， TPC）
使用改良的Folin-Ciocalteu法量化总酚含量。在此过程中，将60 μL样品与300 μL Folin-Ciocalteu试剂和3 mL蒸馏水混合。搅拌混合物并静置3分钟。随后加入0.9 mL 15%碳酸钠溶液和1.74 mL蒸馏水。使反应混合物显色2小时，之后使用紫外-可见分光光度计在765 nm处测量吸光度。通过将吸光度与没食子酸标准曲线（浓度范围为0至1000 μM）进行比较来确定酚含量。结果表示为每克蜂胶提取物的没食子酸当量毫克数（mg GAE g-1）。
2.3.3. 总黄酮化合物（Total Flavonoid Compounds， TFC）
提取物的总黄酮含量分析遵循Ozsoy等人概述的方法并进行修改。使用紫外-可见分光光度计在510 nm处测量吸光度。使用儿茶素作为标准品量化黄酮含量，结果表示为每克干样品的儿茶素当量毫克数（mg CE g-1）。
2.3.4. 通过DPPH和铁还原抗氧化能力测定法评估抗氧化活性
使用DPPH和FRAP方法进行体外抗氧化活性评估。对于DPPH自由基清除活性，采用Brand-Williams等人提出的方法。将150 μL每个样品与5850 μL 0.06 mmol L-1DPPH溶液混合。反应30分钟后，使用紫外-可见分光光度计在515 nm处测量吸光度。结果表示为每克蜂胶的Trolox等效抗氧化能力微克数（μg TEAC g-1）。
铁还原抗氧化能力（Ferric-Reducing Antioxidant Power， FRAP）测定遵循Benzie和Strain的程序进行，略有修改。反应混合物由100 μL样品、100 μL 3 mmol L-1氯化铁和1800 μL TPTZ溶液（2,4,6-三（2-吡啶基）-1,3,5-三嗪）组成。样品在37°C孵育30分钟。使用紫外-可见分光光度计在620 nm处记录吸光度。结果也表示为μg TEAC g-1。
2.4. 提取后固体残留物的表征
提取后，反应器中剩余的固体残留物在强制空气对流烘箱中于105°C干燥24小时。使用同步热分析仪通过热重分析（TGA）分析初始原料和最终固体残留物。
使用高分辨率扫描电子显微镜（FEG-SEM）检查样品的表面形态。样品固定在双面胶带上并涂覆薄金层。电子束以10 kV的加速电压运行。
2.5. 统计分析、建模和优化
获得的结果提交给方差分析（ANOVA），以评估具有统计学显著性的因素和变量之间的交互效应。通过Tukey检验确定显著性差异（p ≤ 0.05）。所进行分析的实验结果通过响应面法（Response Surface Methodology， RSM）描述的二阶方程进行分析。通过RSM确定了所研究的三个响应变量的回归系数。回归系数的显著性检验也通过ANOVA确认（p ≤ 0.05）。此外，使用单纯形法优化了响应变量。
所有统计分析均在MiniTab软件中进行。
3. 结果与讨论
3.1. 视觉外观和颜色参数
提取物PLE-1和PLE-14的视觉外观如图2a所示。总的来说，所有处理产生的提取物均呈黄棕色色调（图2b），表明可能存在酚类化合物和黄酮类化合物。随着提取时间的推移，特别是在pH值更碱性的样品中，提取物颜色变深，变为深棕色。这种颜色变化可能与美拉德（Maillard）反应产物有关，源于糖的焦糖化和氨基酸的降解。
比色参数（表2）支持了这些视觉观察。亮度（L）值范围从70.49 ± 3.34到90.68 ± 4.20，较低的值对应于颜色较深的提取物，特别是在高温和碱性pH条件下。代表红-绿光谱的a值在-4.43 ± 0.54到10.26 ± 3.37之间变化。较高的a值表明向更偏红色的色调转变，这在经受极端提取条件的样品中尤其明显。同样，反映黄-蓝光谱的b值范围从29.43 ± 1.40到61.36 ± 7.15，证实了所有样品中黄棕色调的主导地位。
色度（C*）值遵循类似趋势，在最严苛的提取条件下观察到最高强度（62.80 ± 9.31）。这表明色素浓度更高，可能存在降解产物。色调角（H°）范围从-3.06 ± 0.12到1.87 ± 0.11，表明由于提取物之间化学成分的差异可能导致颜色发生细微变化。
这些结果强调了工艺参数对提取物的视觉和比色特性的显著影响，突出了优化水解条件以控制最终产品的化学成分和美学品质的必要性。
3.2. 总酚化合物
棕蜂胶提取物中的TPC结果如图3a和表3所示。浓度范围从58.71 ± 1.74 mg GAE g-1到144.55 ± 8.73 mg GAE g-1，最低值出现在PLE 7处理（80%乙醇，120 °C，pH 2），最高值出现在PLE 9处理（0%乙醇，90 °C，pH 7）。
这些数值总体上与文献报道一致。例如，一项研究使用80%乙醇提取（1:25 m v-1）来自韩国不同地区的棕蜂胶，报告的酚含量范围从48.5到238.9 mg GAE g-1。同样，文献记录了巴西蜂胶中126.8 ± 4.12 mg GAE g-1，中国蜂胶中132.1 ± 3.28 mg GAE g-1和澳大利亚蜂胶中142.4 ± 3.61 mg GAE g-1的浓度。此外，对使用不同溶剂系统提取的立陶宛蜂胶的研究发现，TPC值范围从85.4 ± 1.65 mg GAE g-1到175.6 ± 1.89 mg GAE g-1。
虽然本研究的结果落在先前研究中观察到的广泛范围内，但存在一些差异。这些差异可归因于几个因素，包括提取条件（例如，溶剂组成、温度和pH），这些条件显著影响酚类化合物的回收效率。此外，蜂胶的植物和地理起源深刻影响其化学特征，因为它决定了蜜蜂采集的植物树脂的多样性和丰度。许多研究强调这一因素是不同样品间TPC变异性的主要决定因素。
总酚化合物的量化尤为重要，因为这些化合物主要负责蜂胶的许多生物学和功能特性，包括抗氧化、抗炎、抗菌和抗癌活性。高TPC水平通常与更强的自由基清除能力相关，使得酚类化合物成为蜂胶基产品治疗潜力和质量的关键指标。因此，优化提取方法以最大化TPC回收不仅对于科学表征至关重要，而且对于增强蜂胶在药物、营养保健和化妆品配方中的功能应用也至关重要。
3.3. 总黄酮化合物
黄酮类化合物是一类广泛分布于植物性食品（如蜂蜜和葡萄酒）中的多酚次生代谢物。黄酮类化合物以其多样化的生物活性而闻名，具有抗氧化、抗炎、抗突变和抗癌特性，使其在各种健康相关和工业应用中具有价值。由于这些益处，它们被广泛用于制药、营养保健和化妆品行业。
棕蜂胶提取物中的TFC总结在表3和图3b中，数值范围从13.47 ± 0.54 mg CE g-1（PLE 11：40%乙醇，60 °C，pH 7）到56.01 ± 3.37 mg CE g-1（PLE 8：80%乙醇，120 °C，pH 12）。这些结果与文献发现一致，例如使用70%乙醇报道的安纳托利亚蜂胶为19.34 mg CE g-1，以及使用95%乙醇在罗马尼亚棕蜂胶中发现的53.72–97.65 mg CE g-1范围。使用乙醇、丙酮和乙酸乙酯等溶剂进行超声波辅助提取的报告值显著更高，高达269.74 ± 0.55 mg CE g-1。
这些结果之间的差异是预期的，主要受提取参数（例如，溶剂类型、温度、pH和提取技术）和原材料特征的影响。一个关键因素是蜂胶的地理和植物起源，因为蜜蜂可获得的植物来源显著影响其化学特征。
黄酮类化合物的量化至关重要，因为这些化合物在蜂胶的生物学功效中起着核心作用。特别是，它们对其抗氧化能力贡献很大，这对于中和与慢性疾病相关的氧化应激至关重要。因此，优化提取条件以最大化黄酮产率可增强蜂胶基产品的功能价值和商业潜力。
3.4. 抗氧化活性
3.4.1. DPPH
通过PLE获得的棕蜂胶提取物的DPPH抗氧化活性结果如表3和图3c所示。数值范围从PLE 2处理（0%乙醇，60 °C，pH 12）的54.66 ± 3.16 μmol TEAC g-1到PLE 13处理（40%乙醇，90 °C，pH 2）的304.82 ± 0.40 μmol TEAC g-1。这些发现强调了提取条件，特别是溶剂浓度、温度和pH，对提取物抗氧化活性的显著影响。
相比之下，在墨西哥东南部进行的一项研究评估了来自不同养蜂场的蜂胶，报告了DPPH值范围从200到2710 μmol TEAC g-1。在该研究中，提取物通过将6 g蜂胶与20 mL 96%乙醇混合制备，随后在室温（25°C）下黑暗中以100 rpm振荡12天。随后在减压下蒸发提取物并重新溶于乙醇中。同样，另一项分析来自西班牙北部的31个蜂胶样品的研究报告平均抗氧化活性为1114.28 μmol TEAC g-1，使用70%水醇溶液在20°C下进行两阶段浸渍过程，持续48小时。在哥伦比亚棕蜂胶中，通过不同方法获得的提取物显示出相对较低的抗氧化活性：86.63 ± 0.42 μmol TEAC g-1（索氏提取法）、99.26 ± 0.34 μmol TEAC g-1（超声波辅助法）和101.79 ± 0.38 μmol TEAC g-1（超临界CO2）。
研究中抗氧化能力的广泛变异性反映了提取方法、溶剂系统和原材料起源的综合影响。值得注意的是，尽管本工作中获得的DPPH值通常低于使用长时间或多步骤提取方案报告的值，但与通过索氏提取法或绿色提取技术获得的值相当或更高，强调了在优化条件下PLE的效率。
DPPH自由基清除活性的测定很重要，因为它可作为蜂胶提取物抗氧化潜力的代表，这与其酚类化合物和黄酮类化合物的含量密切相关。抗氧化剂能中和自由基，被认为有益于预防与氧化应激相关的疾病，包括心血管疾病、神经退行性疾病和癌症。因此，优化提取方案以增强抗氧化剂产率对于最大化蜂胶衍生产品的治疗和商业价值至关重要。
值得注意的是，报告极高抗氧化活性值的研究通常采用长提取时间、高溶剂-固体比和多步浓缩程序，这与本研究中应用的短停留时间和连续溶剂更新的半连续PLE系统有根本不同。因此，应谨慎解释直接数值比较，因为方法论方法和过程强度存在显著差异。
3.4.2. 铁还原抗氧化能力
通过PLE获得的棕蜂胶提取物的FRAP抗氧化活性总结在表3和图3d中。结果显示范围从PLE 1处理（0%乙醇，60 °C，pH 2）的238.4 ± 24.66 μmol TEAC g-1到PLE 8处理（80%乙醇，120 °C，pH 12）的385.37 ± 18.88 μmol TEAC g-1。这些数值突出了提取参数，特别是乙醇浓度和温度，对蜂胶提取物还原能力的影响。
比较研究揭示了FRAP活性的广泛范围，取决于提取条件和地理起源。例如，来自伊朗三个地区的蜂胶通过精细切割原材料并在25 mL 95%乙醇中搅拌24小时进行提取。所得提取物在100至2000 μg mL-1浓度下表现出FRAP值范围从125.25到3381.64 μmol mL-1，显示出取决于样品和浓度的显著变异性。在土耳其，另一项调查分析了19个蜂胶样品，使用80%乙醇（每10 mL溶剂1 g蜂胶）超声处理45分钟进行提取，报告FRAP活性在62.3和1396 μmol TEAC g-1之间。
这些研究中报告的FRAP抗氧化活性的广泛变异性强调了提取方法、溶剂系统、样品浓度和植物起源对蜂胶抗氧化能力的强烈影响。FRAP测定测量抗氧化剂将三价铁（Fe3+）还原为二价铁（Fe2+）离子的能力，补充了DPPH等其他测定，以提供抗氧化潜力的全面概况。这些评估共同证实，蜂胶是抗氧化剂的丰富来源，在针对氧化应激相关健康状况的药物和营养保健应用中具有相当大的前景。
研究中报告的抗氧化活性的差异受到提取模式和过程强度的强烈影响。批处理系统和长浸渍时间倾向于促进化合物积累，通常导致更高的抗氧化值。相比之下，本研究中应用的半连续PLE系统优先考虑快速传质、溶剂更新和过程选择性，这可能限制化合物积累但增强了重现性、效率和可持续性。此外，升高的温度可能促进热不稳定酚类的部分降解，进一步导致抗氧化反应的差异。
3.5. 统计建模和优化
使用23RSM设计（包括中心点的重复）研究了乙醇浓度、温度和pH的影响。对所有从PLE过程获得并通过ANOVA分析的响应变量评估了包含二阶函数的统计模型。图4显示了每个响应变量的帕累托图。
对于总酚含量、总黄酮含量以及DPPH和FRAP抗氧化活性，所有三个因素——A（乙醇百分比）、B（温度，°C）和C（pH）——对提取的生物活性化合物的数量表现出统计学显著影响（p < 0.05）。这些发现在表4所示的ANOVA结果中得到进一步支持。
对于TPC，乙醇浓度、温度和pH的p值均<0.05，表明具有统计学显著效应。所有模型中相对较低的残差误差值表明统计模型有效地捕获和预测了基于实验中使用的变量的系统行为。
乙醇浓度、温度和pH的协同效应如图5所示。在图5a中，垂直轴代表TPC，而水平轴对应于乙醇浓度和温度。曲线描绘了pH与这些变量的相互作用。酚类化合物的提取随着乙醇浓度的增加而增加，特别是在高温（90–120 °C）下，这表明存在协同效应，其中中到高的温度增强了乙醇的溶剂能力。在所有pH水平下，TPC随着乙醇浓度的增加而增加；然而，最高值出现在pH 2。酸性条件可能促进酚类化合物从基质中释放。此外，较高的温度进一步提高了TPC产率，pH 2再次产生最有利的结果。这些发现表明，酚类化合物在酸性和高温条件下更容易提取。在图5b中，TFC随着乙醇浓度稳定增加，在90至120°C之间的温度下观察到更明显的效果。尽管黄酮类化合物对温度变化的敏感性低于酚类化合物，但它们仍然受益于增强的溶剂强度。随着乙醇浓度的增加，TFC显著改善，特别是在酸性条件（pH 2）下。相比之下，碱性条件（pH 12）限制了黄酮类化合物的提取。较高的温度也促进提取，pH 2产生最高的TFC值。在图5c中，DPPH值随着乙醇浓度增加直至大约80%，之后趋于稳定或略有下降，特别是在60°C。最大抗氧化活性在中等乙醇浓度和90至120°C之间的温度下观察到。中等乙醇水平和pH 2的组合产生最高的DPPH值，而碱性条件（pH 12）降低了抗氧化活性。总的来说，DPPH活性随着温度升高而改善，特别是在酸性条件下。在图5d中，FRAP遵循与DPPH类似的趋势。数值随着乙醇浓度和温度的增加而增加。最高的FRAP在120°C和80–100%乙醇下实现。pH 2始终产生最高的FRAP值，而碱性pH条件削弱了提取物的还原能力。与DPPH一样，FRAP活性随着温度升高而改善，特别是在酸性条件下。
总之，在所有评估的响应（TPC、TFC、DPPH和FRAP）中，较高的乙醇浓度（80–100%）与升高的温度（90至120 °C）相结合始终提高了提取效率。酸性条件（pH 2）在所有情况下都有利于生物活性化合物的回收，表明酸水解或pH介导的增溶作用有助于这些化合物的释放。交互作用图强调了同时优化所有三个变量的重要性，因为它们的影响不仅是加性的，而且是协同的。
为响应变量生成了水平曲线（图6）。总酚含量（TPC）在较高温度、较高乙醇浓度和较低pH水平下最大化，如图6a中的深绿色区域所示。总黄酮含量（TFC）观察到类似趋势，如图6b所示。对于DPPH抗氧化活性（图6c），最高值在中等温度（90–105 °C）、中等乙醇浓度（40–60%）和酸性条件（pH < 6）下实现。对于FRAP抗氧化活性（图6d），最大值在最高乙醇浓度和温度以及最低（最酸性）pH水平下获得。
TPC、TFC、DPPH和FRAP的方程，以及调整回归模型中变量的二阶函数的决定系数如下。
观察到决定系数（R2）高于0.733，表明模型拟合了实验数据。为了优化因子设计并最大化响应变量的值，将获得的模型进行单纯形法分析，以确定产生最佳量生物活性化合物的因素的最佳值。使用Microsoft Office Excel中的规划求解工具进行计算。软件中使用的限制是因子设计施加的水平，0 ≤ A ≤ 80%，60 ≤ B ≤ 120 °C，和2 ≤ C ≤ 12，目标就是响应变量本身。获得生物活性化合物最大值的优化结果和条件为：乙醇（A）= 65%，温度（B）= 120 °C，pH（C）= 2；生成TPC = 146.54 mg GAE g-1，TFC = 52.25 mg CE g-1，DPPH = 306.56 μmol TEAC g-1，和FRAP = 394.71 μmol TEAC g-1。这些不同的优化条件是理想的，因为可以根据要生产的理想生物活性来改变操作条件。
3.6. 提取后固体残留物的表征
图7展示了使用热分析（TGA/DTG）和形态分析（SEM）对PLE后获得的固体残留物进行的全面表征。图7a，b分别显示了所有16个PLE处理（PLE-1至PLE-16）的热重和微分热重曲线。TGA曲线揭示了样品间一致的热降解模式，主要质量损失事件发生在大约250至450°C之间。这种行为是木质纤维素生物质的典型特征，对应于半纤维素、纤维素和木质素的分解。在150°C以下观察到轻微的初始质量损失，可能是由于水分蒸发和低分子量挥发物的损失。在高于约470°C的温度下，质量损失趋于平稳，表明形成了热稳定的碳质残留物（焦炭）。
DTG曲线（图7b）通过显示质量损失率随温度的变化进一步阐明了这些差异。大多数样品在370至390°C之间呈现出一个明显的峰值，代表主要分解步骤。样品间峰值强度和温度最大值的变化反映了热不稳定组分相对丰度的差异。
扫描电镜下选定残留物的形态特征如图7c-f所示。样品PLE-1（图7c），在60°C、0%乙醇和pH 2下提取，显示出紧凑致密的形态，几乎没有可辨别的孔隙或纤维，表明植物基质破坏有限。相比之下，PLE-5（图7d），在相同温度但使用8
