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这篇综述系统阐述了约束型双环肽（Bicycle molecules）作为一种新型抗体模拟物，在体外诊断（IVD）领域展现出巨大的应用潜力。文章详细介绍了其通过噬菌体展示技术筛选、针对SARS-CoV-2核衣壳（N）蛋白的发现过程，并验证了其在酶联免疫吸附试验（ELISA）、纳米酶联免疫吸附试验（NLISA）以及侧向流动免疫分析法（LFIA）等多种诊断平台中的优异性能，实现了对目标抗原的超灵敏检测。研究强调了这类合成肽分子因其高亲和力、易于位点选择性修饰和规模化生产等优势，有望成为开发稳健、经济高效生物传感器的关键元件。
引言：诊断技术中的生物识别元件
生物传感器与诊断技术的核心在于能够特异且高效结合疾病指示靶标的生物识别元件。尽管生物传感器检测的基础模块化平台已很成熟，但其对特定生物标志物的检测适应性取决于所用结合剂的目标特异性。因此，在开发高性能诊断平台时，生成对相关生物标志物表位具有高亲和力和高度特异性靶向的结合构建体至关重要。
最常见的生物标志物靶标识别方法涉及一对生物识别元件，通过形成“夹心复合物”来固定探针，从而阳性指示生物标志物的存在（或在某些情况下为不存在）。这对生物识别元件在复合物形成中具有不同作用：“捕获”元件固定在表面并固定靶抗原，而“检测”元件则与指示探针相连。为了最大化灵敏度，两种识别元件通常不竞争同一表位。实验室环境中的主要抗原检测方法（酶联免疫吸附试验，ELISA）和现场即时检测（侧向流动免疫分析法，LFIA）通常依赖夹心复合物的形成来实现生物标志物的定量、半定量或定性检测。在大多数情况下，抗体因其足够的灵敏度（靶抗原与抗体之间的固有结合亲和力）、一般特异性（使用单克隆抗体时可接受的脱靶结合）以及成熟的制造工艺而被采用。
约束型双环肽：一类新型亲和剂
约束型双环肽（Bicycle molecules）是一类新型亲和剂，因其高亲和力（纳摩尔至皮摩尔级）、对目标靶标的绝对选择性以及低分子量（可实现有效的组织穿透）而作为靶向癌症治疗药物崭露头角。Bicycle分子是化学约束的双环肽，通常由10-20个氨基酸组成，已被发现其结合亲和力可直接与抗体相媲美。由于其极简的架构和缺乏高阶结构，与传统的生物识别元件相比，Bicycle分子有望提供更优越的稳定性，并通过减少非特异性结合相互作用而显著提高特异性。这是通过省略IgG和其他抗体衍生物或模拟物中通常存在的、对靶标识别不必要且可能促进不良分子间相互作用的冗余蛋白质结构域来实现的。
此外，其化学合成允许Bicycle分子在与抗原结合位点远离的位置轻易且位点特异性地进行修饰，这对于基于抗体的替代品来说是出了名的困难。这一特性对于结合剂在免疫测定中的有效使用尤为重要，因为结合位点的定向和无阻碍呈现对于获得最佳生物测定性能至关重要。另外，Bicycle分子的化学合成确保了大规模、批次间一致的生产，与免疫球蛋白制造相比具有显著优势。这些特性表明，Bicycle分子可能代表了一类在体外生物标志物检测中用于生物传感器的理想生物识别元件。
本研究展示了针对严重急性呼吸综合征冠状病毒2核衣壳（SARS-CoV-2 N）蛋白鉴定出的位点特异性生物素化Bicycle分子的用途。选择该蛋白作为靶标是因为其在冠状病毒中丰度高，是疾病检测的最佳生物标志物。这些Bicycle分子在酶联免疫吸附试验（ELISA）和纳米酶联免疫吸附试验（NLISA）中被评估为有效的生物识别元件。该方法还扩展到用于检测超低浓度SARS-CoV-2 N蛋白的比色纳米粒子和纳米酶侧向流动免疫分析法（LFIA）。
噬菌体展示筛选
为了获得针对SARS-CoV-2核衣壳（N）蛋白的新型亲和剂，使用来自SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1株的化学生物素化全长、C端结构域（CTD）或N端结构域（NTD）重组蛋白作为靶材料，在基于溶液的淘选筛选中使用Bicycle噬菌体库。这些库由包含三个半胱氨酸的线性肽（长度10-20个氨基酸）组成，这些肽在原位环化形成硫醚键连接的双环肽库。经过四轮筛选后，分离富集的噬菌体克隆，进行测序，并使用AlphaScreen测定法筛选其蛋白质结合能力。选定的亲和剂被合成为肽，并通过生物层干涉技术（BLI）表征其针对每种蛋白质构建体的结合亲和力。这鉴定出了具有微摩尔至低纳摩尔亲和力的结合剂，并证明可以容易且快速地获得靶向N蛋白不同区域的独特Bicycle分子。随后，一系列结合剂被合成为带有生物素标签的形式，以便在诊断平台中探索亲和力、表位和序列家族的最佳组合。
ELISA筛选检测SARS-CoV-2 N蛋白的夹心对
为了在ELISA中灵敏特异地检测靶抗原，需要一对能够协同识别靶抗原的生物识别元件。这项概念验证研究选择了杂交夹心格式（利用Bicycle捕获和抗体检测探针）。虽然理论上可以实现完全的Bicycle-Bicycle夹心，但使用生物素化Bicycle分子作为检测探针需要仔细设计以防止与链霉亲和素表面的交叉反应。
为了评估生物素化Bicycle分子在板式体外蛋白质检测中的适用性，试验了由四种抗SARS-CoV-2 N蛋白NTD的单克隆IgG与四种生物素化Bicycle分子（B001、B002、B003和B004）组合得到的16对生物识别元件对，以确定检测重组SARS-CoV-2 N蛋白的最佳配对。在50 ng·mL–1的N蛋白浓度下，大多数试验的组合产生了高于其相应背景（无抗原存在的类似实验）的可观测信号。值得注意的是，结合N蛋白CTD的Bicycle分子（B003和B004）似乎具有更优越的性能，与针对N蛋白NTD生成的Bicycle分子相比，提供了更高的信噪比（S/N）。
尽管如此，观察到所有四种使用B003作为捕获生物识别元件的组合，对于检测50 ng·mL–1的重组SARS-CoV-2 N蛋白提供了最大的S/N。使用不同浓度N蛋白进一步测试这四对组合，得到了典型的剂量-反应曲线。利用一种源自Holstein等人的稳健统计方法计算检测限（LoD）值，该方法考虑了空白样品和测试样品的方差。预测生物识别元件对B003–40588-MM124在检测较低浓度的SARS-CoV-2 N蛋白方面潜力最大，因为该对计算出的LoD最低。因此，选择B003–40588-MM124作为最终配对，生成全面的ELISA校准曲线，并对其他已知人类冠状病毒（HCoV）的N蛋白进行交叉反应研究。在优化条件下，观察到对SARS-CoV-2 N蛋白的最终LoD为250 pg·mL–1。决策限（定义为空白平均值加上三倍空白标准差，即S0+ 3σS0）计算为180 pg·mL–1。未观察到与其他HCoV N蛋白的交叉反应。
NLISA筛选检测SARS-CoV-2 N蛋白的夹心对
NLISA是一种日益流行的体外蛋白质检测技术，其中纳米酶模拟ELISA格式中使用的酶探针的作用。用纳米酶代替生物酶探针通常使NLISA格式相对于ELISA获得更高的灵敏度，并且允许更大的生物识别元件兼容性。
随后重复了类似ELISA开发的过程，以证明生物素化Bicycle分子在NLISA格式中的可行性。在NLISA格式中使用了模拟过氧化物酶的铂基纳米催化剂（PtNCs）作为检测探针。在10 ng·mL–1重组SARS-CoV-2 N蛋白浓度下进行初步筛选，观察到几乎所有配对都产生了高于其相应背景的可观测信号。与ELISA筛选结果一致，在ELISA筛选中提供显著信噪比的配对组合在NLISA格式中也产生良好的信噪比。
尽管如此，观察到了三对优异的配对，并在不同浓度重组SARS-CoV-2 N蛋白下进一步测试这些组合，得到了典型的剂量-反应曲线。B004–40143-MM08最终被选为最有可能检测较低浓度N蛋白的配对组合，因为该对显示出最低的计算LoD。计算生成曲线的LoD值后，选择B004–40143-MM08生物识别元件对作为最终配对，生成全面的NLISA校准曲线，并对其他已知HCoV的N蛋白进行交叉反应研究。在优化条件下，观察到对SARS-CoV-2 N蛋白的最终LoD为97 pg·mL–1，决策限为23 pg·mL–1。未观察到与其他HCoV核衣壳蛋白的交叉反应。
Bicycle分子在纸基免疫测定中的应用
纸基诊断技术是目前用于现场即时检测疾病指示性生物标志物的旗舰生物测定平台。在证明了Bicycle分子作为板式免疫测定中有效捕获生物识别元件的性能后，我们的注意力转向了验证生物素化Bicycle分子在纸基诊断平台中的使用。
纳米酶LFIA
与通常使用金纳米颗粒（AuNPs）作为指示探针的标准比色LFIA相比，使用模拟过氧化物酶的纳米酶可以实现超低的可视检测限，因为比色底物的催化氧化导致信号放大输出。由此产生的测试线强度增加允许识别那些在使用典型比色纳米颗粒探针时本无法检测到的可见测试线。
为了确定哪些生物识别元件对在LFIA中表现最佳，我们最初进行了涉及所有16对Bicycle-IgG组合的初步筛选。使用临床相关的SARS-CoV-2 N蛋白浓度（1 ng·mL–1）作为靶抗原来评估这些配对的LFIA性能。如图所示，有几对组合成功地以信号放大LFIA格式检测到1 ng·mL–1的SARS-CoV-2 N蛋白。值得注意的是，检测IgG生物识别元件的选择似乎是衡量非特异性结合（NSB）的合理指标。
总体而言，配对组合在LFIA筛选过程中的表现与其在NLISA筛选中的表现之间的关系似乎有些变幻莫测。这表明生物识别元件在板式诊断中的性能并不能预示其在纸基诊断中的表现，因此建议针对不同生物测定平台应用的生物识别元件对应独立评估。
–1 SARS-CoV-2 N蛋白浓度下展示生物识别元件对LFIA信号减去噪声矩阵的试纸条。(B) 相应的生物识别元件对LFIA信号减去噪声矩阵热图。(C) 代表性试纸条显示在不同稀释度SARS-CoV-2 N蛋白下的扩增前和扩增后测试线强度。星号表示肉眼可见的最低抗原浓度的LFIA试纸条。(D) 相应的校准曲线，显示LFIA中SARS-CoV-2 N蛋白扩增前和扩增后检测的归一化测试线强度。(E) 针对1 μg·mL–1HCoV N蛋白的LFIA交叉反应研究。">
虽然配对B001–40143-MM123在1 ng·mL–1SARS-CoV-2 N蛋白与空白样品测试线信号之间提供了最大的差异；但最终选择了生物识别元件对B001–40143-MM05作为最终配对，因为在空白样品中没有可见的测试线，即使在信号放大后也是如此，表明几乎没有NSB，同时也提供了相似的测试线强度差异。
使用连续稀释的SARS-CoV-2 N蛋白测试了生物识别元件对B001–40143-MM05，由此产生的测试线强度呈现剂量-反应关系。经过显色信号放大后，观察到更高的测试线强度，随后能够检测到更低量的抗原。正如预期，测试线强度随着稀释倍数的增加而逐渐降低，并且在不存在抗原时没有可观察到的测试线。可视检测限（vLoD）被评估为肉眼可见测试线的最低抗原浓度。在扩增前，SARS-CoV-2 N蛋白在0.62 ng·mL–1被成功检测到，而在显色扩增后，实现了0.04 ng·mL–1的vLoD。这代表了超越商业快速抗原检测试剂的LoD。最后，针对其他人类冠状病毒核衣壳蛋白的交叉反应研究显示没有可见的测试线，即使经过催化信号放大，突出了所用生物识别元件和生物测定的特异性。
AuNP LFIA
在优化了B001–40143-MM05生物识别元件对在纳米酶LFIA中的性能后，我们认为有必要在更熟悉的行业标准金纳米颗粒（AuNP）比色LFIA中展示该生物识别元件对的使用。检测剂40143-MM05 IgG被吸附到40 nm AuNPs上，在使用生物素化Bicycle分子B001作为捕获剂的半试纸条LFIA格式中，实现了0.8 ng·mL–1的vLoD。这基本上与半试纸条纳米酶LFIA的扩增前性能相当。
由于使用AuNPs作为纳米颗粒探针是目前现场即时LFIA设备中的黄金标准，我们试图展示使用B001–40143-MM05生物识别元件对所开发的AuNP半试纸条LFIA的性能，并使用混合唾液作为临床相关的样本基质进行生物测定。使用样本缓冲液（1:1 人混合唾液与运行缓冲液），半试纸条LFIA的比较性能得以实现，vLoD为0.8 ng·mL–1。这表明，与典型的抗原加标缓冲液相比，整合Bicycle分子的AuNP LFIA的性能不受临床相关样本基质使用的影响。使用各种HCoV的N蛋白进行的交叉反应实验显示没有可见的测试线。
值得注意的是，这里实现的检测限（AuNP LFIA为0.8 ng·mL–1，纳米酶LFIA为40 pg·mL–1）与文献中报道的最先进的基于抗体的传感器相比具有高度竞争力。
结论
约束型双环肽代表了一类新型的生物识别元件，其极简的架构构成了用于生物测定的最小（如果不是最小）的氨基酸衍生生物识别部分之一。我们已经证明，它们可以作为抗体的优秀补充，并且可以有效地整合到板式和纸基诊断中用于蛋白质抗原检测。利用针对SARS-CoV-2 N蛋白NTD或CTD制备的Bicycle分子作为Bicycle-IgG生物识别元件对中的捕获试剂，我们在标准夹心ELISA格式中实现了250 pg·mL–1的检测限（LoD），在AuNP半试纸条LFIA中获得了0.8 ng·mL–1的可视LoD。此外，通过整合催化铂基纳米酶，我们进一步提高了这些检测限，在夹心格式NLISA中达到97 pg·mL–1的LoD，在信号放大的纳米酶半试纸条LFIA中达到超低的40 pg·mL–1vLoD。在所有开发的生物测定中，未观察到与其他HCoV的交叉反应。我们假设，Bicycle分子的极简架构有助于最大限度地减少脱靶和非特异性结合效应，而其合成生产能够实现易于进行的位点选择性修饰，这在利用各种纳米材料作为信号标记的诊断生物测定制备中被证明极为有效。因此，Bicycle分子为免疫测定中的抗体提供了一种可行的替代方案，并且该平台识别多个差异化命中序列的多样性支持为各种疾病靶标开发多样化的生物测定方法。
